2 第二讲(2) 限制性酶的反应系统
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生物化学《2酶化学》2
习惯名称:谷丙转氨酶 系统名称:丙氨酸：-酮戊二酸氨基转移酶 酶催化的反应:
-酮戊二酸 + 丙氨酸谷氨酸 + 丙酮酸
*国际生物化学会酶学委员会（Enzyme Commsion）将酶分成
六大类：1.氧还原酶类，2.移换酶类，3.水解酶类，4.裂合酶类
，5.异构酶类，6.合成酶类 * 每一种酶有一个编号,如乙醇脱氢酶
学习内容
1.掌握酶的分子组成。酶的活性中心、酶作用 的专一性、Km值、酶原及酶原激活、变构酶 和酶的共价修饰调节、同工酶的概念。米氏 方程，竞争性抑制、非竞争性抑制和反竞争 性抑制的特点。
2.熟悉单纯酶、结合酶、酶蛋白、辅酶、辅基 的概念，辅酶与维生素的关系，不可逆性抑 制剂对酶促反应速度的影响。
3.了解其余内容。
三、酶的分类及命名
1. 酶的分类（催化反应的类型） (1) 氧化-还原酶 Oxidoreductase
氧化-还原酶催化氧化-还原反应。 主要包括脱氢酶(Dehydrogenase)和氧化酶
(Oxidase)。 如，乳酸(Lactate)脱氢酶催化乳酸的脱氢反应。
C H 3 C H C O O H N A D + C H 3 C C O O H N A D HH +
O H
O
(2) 转移酶 Transferase
转移酶催化基团转移反应，即将一个底物分子的 基团或原子转移到另一个底物的分子上。 例如， 谷丙转氨酶催化的氨基转移反应。
CH3CHCOOH HOOCCH2CH2CCOOH
NH2
O
CH3CCOOH HOOCCH2CH2CHCOOH
O
NH2
(3) 水解酶 Hydrolase
主要包括醛缩酶、水化酶及脱氨酶等。 例如， 延胡索酸水合酶催化的反应。
-酮戊二酸 + 丙氨酸谷氨酸 + 丙酮酸
*国际生物化学会酶学委员会（Enzyme Commsion）将酶分成
六大类：1.氧还原酶类，2.移换酶类，3.水解酶类，4.裂合酶类
，5.异构酶类，6.合成酶类 * 每一种酶有一个编号,如乙醇脱氢酶
学习内容
1.掌握酶的分子组成。酶的活性中心、酶作用 的专一性、Km值、酶原及酶原激活、变构酶 和酶的共价修饰调节、同工酶的概念。米氏 方程，竞争性抑制、非竞争性抑制和反竞争 性抑制的特点。
2.熟悉单纯酶、结合酶、酶蛋白、辅酶、辅基 的概念，辅酶与维生素的关系，不可逆性抑 制剂对酶促反应速度的影响。
3.了解其余内容。
三、酶的分类及命名
1. 酶的分类（催化反应的类型） (1) 氧化-还原酶 Oxidoreductase
氧化-还原酶催化氧化-还原反应。 主要包括脱氢酶(Dehydrogenase)和氧化酶
(Oxidase)。 如，乳酸(Lactate)脱氢酶催化乳酸的脱氢反应。
C H 3 C H C O O H N A D + C H 3 C C O O H N A D HH +
O H
O
(2) 转移酶 Transferase
转移酶催化基团转移反应，即将一个底物分子的 基团或原子转移到另一个底物的分子上。 例如， 谷丙转氨酶催化的氨基转移反应。
CH3CHCOOH HOOCCH2CH2CCOOH
NH2
O
CH3CCOOH HOOCCH2CH2CHCOOH
O
NH2
(3) 水解酶 Hydrolase
主要包括醛缩酶、水化酶及脱氨酶等。 例如， 延胡索酸水合酶催化的反应。
基因工程的酶学基础
DNA甲基化对酶活性的影响 •大多数大肠杆菌菌株中含有Dam甲基化酶 和Dcm甲基化酶。 •Dam可以在GATC序列中腺嘌呤N-6位上 引入甲基 •Dcm在CCA/TGC序列的第一个胞嘧啶C-5 位置上引入甲基。 •部分限制性内切酶对甲基化的DNA不能切 割，如FbaI和MboI等。
通常有两种方法： ①选用上述酶的同功酶，如Sau3AI，DNA 识别切割位点与MboI相同；但不受甲基化 影响； ②利用甲基化酶缺失的受体细胞进行DNA 的制备，如E. coli & nbsp; JM110和链霉菌 等，前者Dam和Dcm甲基化酶已敲除，而 后者细胞内本就没有甲基化酶，从这些细 胞中抽提的DNA就能被上述酶切割。
CATG
SAGE Tag 5
CATG
SAGE Tag 2
SAGE Tag 4
SAGE Tag 6
•II型限制性内切酶的酶切位点位于识别位点之中或
附近，产生以下4种情况。 ① 5’粘性末端；② 3’粘性末端；③ 平末端和 ④ 非互补的粘性末端 •无论DNA的来源如何，只要是使用同一种限制性内 切酶，所留下的残端都是一样的。 •经酶切后，5’端总是保留一个磷酸根；3’端总是 保留一个OH
第二讲 基因工程的酶学基础
本节内容
•限制性内切酶—主要用于DNA分子的特异切割 •DNA甲基化酶—用于DNA分子的甲基化 •核酸酶—用于DNA和RNA的非特异性切割 •核酸聚合酶—用于DNA和RNA的合成 •核酸连接酶—用于DNA和RNA的连接 •核酸末端修饰酶—用于DNA和RNA的末端修饰 •其它酶类--用于生物细胞的破壁、转化、核酸纯化、 检测等。
Ⅱ型限制性内切核酸酶的基本特性
1.具有高度特异性的识别位点与酶切位点。 2.辅基： Mg++。 特定识别序列一般长4 - 8对碱基； 大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧；
基因工程中工具酶.限制酶的应用ppt课件
以其功能可分为三大类：核酸降解酶类、核酸合 成酶类、核酸修饰酶类
徐师大-屈艾老师制作
.
3
徐师大-屈艾老师制作
.
4
第一节
限制性核酸内切酶和DNA片段化（九个问题）
一、限制性内切酶的发现 二．核酸内切限制酶的类型 及切割频率 三．核酸内切限制酶的命名原则 四.Ⅱ型核酸限制性内切酶的基本特性 五．影响核酸内切限制酶活性的因素（5点+1） 六. 限制性内切酶反应的终止 七、限制酶消化反应的步骤 八. 使用限制酶的注意点（4点） 九、DNA的片段化
核酸内切限制酶的类型及切割频率1类型特性iiiii型3种不同的亚基单链多肽2种不同的亚基徐师大屈艾老师制作11切割位点距离识别位点的情况在距寄主特异性位点至少1000bp地方可能随机地切割位于寄主特异性位点内或其两侧距寄主特异2426bp处甲基化作用识别未甲基化的序列进行核酸内切酶切割序列特异的切割不是dna克隆中的用处无用十分有用用处不大徐师大屈艾老师制作122切割频率是指某限制性核酸内切酶在dna分子中预期的切割概率
位于寄主特 异性位点内 或其两侧
寄主特异性 的位点
距寄主特异 性位点3，端 24~26bp处
寄主特异性 的位点
识别未甲基 能
能
能
化的序列进
行核酸内切
酶切割
序 列 特 异 的 不是
是
是
切割
DNA 克 隆 中 无用 的用处
徐师大-屈艾老师制作
十分有用
用处不大
.
11
2、切割频率
---是指某限制性核酸内切酶在DNA分子 中预期的切割概率。有了它，又知道DNA序 列的长度，就可以估算该限制性核酸内切酶 在某种DNA分子中的切点数N。
限制酶的特性和作用
０ ５％ Ｂ．０ ． ５％ Ｃ．０． ２ ５％ Ｄ．０． １ ２ ５％
） 。Ａ ．０ ．
高营养级 生物获 能的最 大（ 最 小） 值 的计 算
人可 以获得最大能量是— — 。
例题 ： 上
述 图 ３所示的食 物 网中 ， 若水 藻 的能量值 是 １ Ｏ ｋ ， ｌ ， 则 解析 ： 人要想获得最大能量值 ， 则应选 择人所 在的
方法规律 ： 已知低营养级 的能量值 ， 求高 营养级获
得 的最大 （ 最小 ） 能量值 ， 应 该选取 高营养 级的 生物所
酶 。这类酶能够识 别双链 Ｄ Ｎ Ａ分子 的某 种特 定核 苷
响重组 载体的形成。 如果用两 种 不 同限制 酶 同时 切割 （ 双 酶切 ） 形 成
酸序列 ， 并且使每一 条链 中特定 部位 的两个 核苷酸 之
间 的磷酸二酯键断开。 １ 限制酶的专一性
的 目的基因 、 运载体 ， 不但 可 以连 接起来 ， 而且 一 般情 况下效果 更好 ， 因为这样可以避免 目的基 因、 运 载体 的
育出版社 ， ４ ５ ８—４ ５ ９ ０
量传递效 率为 １ ／ ８ ０ ０×１ ０ ０ ％＝ ０ ． １ ２ ５ ％。 ４ ． ４ 已知较低 营养级的能量 （ 生物量） 值， 但 未知传递
效率和能量传给 下一 营养级 不 同生物 的分 配比例 ， 求
么， 绿色植物到鹰 的能量 传递 效率 为 （
转化为鹰 的食 物链 中各 营养 级 的生 物 量。 即： ｌ ｋ ｇ的
鹰需要小鸟 的生物量 １ ０ ｋ ｇ ， １ ０ ｋ ｇ的小 鸟需 要 昆虫的生 物量 ＝１ ０÷（ ０ ． ５÷ ４ ） ＝８ ０ ｋ ｇ ； ８ ０ ｋ ｇ 的 昆虫需 要绿 色植 物 的生物量 ＝８ ０÷（ １ ０÷１ ０ ０ ） ＝８ ０ ０ ｋ ｇ 。 因此 ， 从绿色植物一 昆虫一小 鸟一 鹰 的生物 量依 次为 ８ ｏ ０ ｋ ｇ 一８ ０ ｋ ｇ 一１ ０ ｋ ｇ 一１ ｋ ｇ ， 则 绿 色植 物 到鹰 的能
） 。Ａ ．０ ．
高营养级 生物获 能的最 大（ 最 小） 值 的计 算
人可 以获得最大能量是— — 。
例题 ： 上
述 图 ３所示的食 物 网中 ， 若水 藻 的能量值 是 １ Ｏ ｋ ， ｌ ， 则 解析 ： 人要想获得最大能量值 ， 则应选 择人所 在的
方法规律 ： 已知低营养级 的能量值 ， 求高 营养级获
得 的最大 （ 最小 ） 能量值 ， 应 该选取 高营养 级的 生物所
酶 。这类酶能够识 别双链 Ｄ Ｎ Ａ分子 的某 种特 定核 苷
响重组 载体的形成。 如果用两 种 不 同限制 酶 同时 切割 （ 双 酶切 ） 形 成
酸序列 ， 并且使每一 条链 中特定 部位 的两个 核苷酸 之
间 的磷酸二酯键断开。 １ 限制酶的专一性
的 目的基因 、 运载体 ， 不但 可 以连 接起来 ， 而且 一 般情 况下效果 更好 ， 因为这样可以避免 目的基 因、 运 载体 的
育出版社 ， ４ ５ ８—４ ５ ９ ０
量传递效 率为 １ ／ ８ ０ ０×１ ０ ０ ％＝ ０ ． １ ２ ５ ％。 ４ ． ４ 已知较低 营养级的能量 （ 生物量） 值， 但 未知传递
效率和能量传给 下一 营养级 不 同生物 的分 配比例 ， 求
么， 绿色植物到鹰 的能量 传递 效率 为 （
转化为鹰 的食 物链 中各 营养 级 的生 物 量。 即： ｌ ｋ ｇ的
鹰需要小鸟 的生物量 １ ０ ｋ ｇ ， １ ０ ｋ ｇ的小 鸟需 要 昆虫的生 物量 ＝１ ０÷（ ０ ． ５÷ ４ ） ＝８ ０ ｋ ｇ ； ８ ０ ｋ ｇ 的 昆虫需 要绿 色植 物 的生物量 ＝８ ０÷（ １ ０÷１ ０ ０ ） ＝８ ０ ０ ｋ ｇ 。 因此 ， 从绿色植物一 昆虫一小 鸟一 鹰 的生物 量依 次为 ８ ｏ ０ ｋ ｇ 一８ ０ ｋ ｇ 一１ ０ ｋ ｇ 一１ ｋ ｇ ， 则 绿 色植 物 到鹰 的能
限制性内切酶原理课件
Not I
限制性内切酶原理
4 DNA甲基化酶
甲基化酶：可以从活性甲基化合物(如S-腺苷甲 硫氨酸)上将其甲基转移到其他化合物的酶。可 形成各种甲基化合物，或是对某些蛋白质或核 酸等进行化学修饰形成甲基化产物。 DNA甲基化酶：以S-腺苷甲硫氨酸为甲基供体， 将甲基转移到DNA特定的碱基上的过程。
限制性内切酶原理
限制性内切酶原理
特殊的II型限制酶
有些限制酶识别的序列不是回文序列。
AccⅠ 的识别切割位点分别是GTAGAC 和 GTCTAC
GT↓ATCGAC CATAGC↑TG
BbvCⅠ 的识别切割位点分别为CCTCAGC和GGAGTCG
CC↓TCAGC GGAGT↑CG
限制性内切酶原理
影响限制性酶活性的因素
HindIII
NNNNNNNNNNNNNNNNNNTNTNC GAAAAGNCNT•T•NN • • • NNNNCNCGTGAAGGTNNNN NCNCNNNNNNNNNNNNNNN NNNNNNNNN
HindIII
BamHI
• • • NNAAGCTTNN • • • NNGGATCCNNN • • • • • • NNTTCG AANN • • • NNCCTAGGNNN • • •
II型限制酶 所识别的序列多为短的回文序列，切割位点与识
别位点一致。是基因工程上，实用性较高的限制酶种
类。例如：EcoRI、HindIII。
III型限制酶 切割位点与识别位点相距24-26个碱基，不能准确
定位切割位点。例如：EcoPI、HinfIII。
限制性内切酶原理
什么是回文序列？
GAATTAAG C TTAATTC
限制性内切酶原理
酶切消化反应的温度
限制性内切酶原理
4 DNA甲基化酶
甲基化酶：可以从活性甲基化合物(如S-腺苷甲 硫氨酸)上将其甲基转移到其他化合物的酶。可 形成各种甲基化合物，或是对某些蛋白质或核 酸等进行化学修饰形成甲基化产物。 DNA甲基化酶：以S-腺苷甲硫氨酸为甲基供体， 将甲基转移到DNA特定的碱基上的过程。
限制性内切酶原理
限制性内切酶原理
特殊的II型限制酶
有些限制酶识别的序列不是回文序列。
AccⅠ 的识别切割位点分别是GTAGAC 和 GTCTAC
GT↓ATCGAC CATAGC↑TG
BbvCⅠ 的识别切割位点分别为CCTCAGC和GGAGTCG
CC↓TCAGC GGAGT↑CG
限制性内切酶原理
影响限制性酶活性的因素
HindIII
NNNNNNNNNNNNNNNNNNTNTNC GAAAAGNCNT•T•NN • • • NNNNCNCGTGAAGGTNNNN NCNCNNNNNNNNNNNNNNN NNNNNNNNN
HindIII
BamHI
• • • NNAAGCTTNN • • • NNGGATCCNNN • • • • • • NNTTCG AANN • • • NNCCTAGGNNN • • •
II型限制酶 所识别的序列多为短的回文序列，切割位点与识
别位点一致。是基因工程上，实用性较高的限制酶种
类。例如：EcoRI、HindIII。
III型限制酶 切割位点与识别位点相距24-26个碱基，不能准确
定位切割位点。例如：EcoPI、HinfIII。
限制性内切酶原理
什么是回文序列？
GAATTAAG C TTAATTC
限制性内切酶原理
酶切消化反应的温度
限制性内切酶.正式版PPT文档
回文序列 • 5'......GAA TTC......3' • 3'......CTT AAG......5'
• 从两侧读都是核苷酸的序列都是5'-GAATTC-3'
限制性内切酶的命名
• 限制性核酸内切酶的命名最早由 ห้องสมุดไป่ตู้mith 等1973 年提出,。
• 1980 年 Robert s 进行系统化和 分类。
同尾酶
许多不同的限制酶切割 DNA 产生的末端是相同的，且是对称的。 它们可产生相同的粘性突出末端。这些酶切割 DNA 得到的产物可进行末
端连接。 以下几种酶产生的末端是相同的· EcoRⅠ G↓AATCC MfeⅠ C↓AATTC ApoⅠ R↓AATTY
限制性内切酶的切割方式
影响限制性内切酶活性的因素
Ⅱ型酶对DNA序列的识别一般具有以下几个特征
①大多数酶的识别序列很严格，少有变动的余地
②识别序列的碱基数一般为4~8对，一般都富含C和G. ③大多数识别位点具有180度旋转对称的回文序列，即有一个 中心对称轴，从这个轴朝两个方向读都完全相同。
④识别序列中的碱基被甲基化修饰后会影响部分酶的切割 效果
限制性内切酶
主要内容 • 限制性内切酶的概念 • 限制性内切酶图谱 • 限制性内切酶的图谱分析法
限制性内切酶
是一类能识别双链DNA特定序列，并使磷酸二酯键断开的内切脱氧 核糖核酸酶， 限制性内切酶根据酶的组成，裂解方式和所需因子的不同分为三种 类型，分别是Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。 Ⅰ型酶主要指的是：一类兼有限制性内切酶和修饰酶活性的多 亚基蛋白复合体。它们可在远离识别位点处任意切割 DNA 链。 能识别特异性的DNA 序列, 但没有固定的切割位点
第二讲 酶活力
酶的一个活力单位（ 酶的一个活力单位（active unit, U，I.U） ， ） 在该酶的最适条件下， 在该酶的最适条件下，在250C，一分钟内催化 1µmol(微摩尔）底物的酶量。（国际酶委员会规定） (微摩尔）底物的酶量。 国际酶委员会规定）
注意： 注意：两个概念的区别
！！
酶活力：是指在一定条件下， 酶活力：是指在一定条件下，酶所催化的反应初速度 比活力：特定条件下，单位重量（mg）蛋白质或RNA所具 比活力：特定条件下，单位重量（mg）蛋白质或RNA所具 RNA 有的酶活力单位数。 有的酶活力单位数。 是酶纯度的量度 酶活力(或总活力)涉及在样品中酶的总单位， 酶活力(或总活力)涉及在样品中酶的总单位，而比活 力是每毫克蛋白质中酶单位的数量（U/mg） 力是每毫克蛋白质中酶单位的数量（U/mg） 比活力是酶纯度的量度， 比活力是酶纯度的量度，在酶的纯化过程中它的比 活力增高，当酶提纯时，其比活力成为极大和恒定的 活力增高，当酶提纯时， 值
酶分析是生化分析的重要内容， 酶分析是生化分析的重要内容，凡 涉及到生化、医疗化验、 涉及到生化、医疗化验、生产实践和基础研 究都离不开酶分析， 究都离不开酶分析，酶本身分离纯化的每一 步也要分析酶，特别是判断每一步效率。 步也要分析酶，特别是判断每一步效率。 包括酶活力测定和酶法分析， 包括酶活力测定和酶法分析，两者检 酶活力测定 测对象不同，但其原理大致一样： 测对象不同，但其原理大致一样：都是利用 酶的专一性、高效催化反应， 酶的专一性、高效催化反应，通过酶反应速 度的测定而检测相应的含量； 度的测定而检测相应的含量；在方法上也都 有一个选择适宜反应条件和测定方法， 有一个选择适宜反应条件和测定方法，以获 得准确可靠的结果的问题。 得准确可靠的结果的问题。
1978诺贝尔——限制酶
1978年诺贝尔生理学或医学奖得主
阿尔伯(Werner Arber 1929～)瑞士生物 学家，史密斯(Hamilton O．Smith 1931～) 美国微生物学家，内森斯(Daniel Nathans 1928～1999)美国微生物学家，由于限制性 核酸内切酶的发现及其在分子遗传学中的 应用，为遗传工程的产生拉开了序幕而获 得1978年诺贝尔生理学或医学奖。
• Arber discovered restriction enzymes. He postulated that these enzymes bind to DNA at specific sites containing recurring structural elements made up of specific basepair sequences. • Smith verified Arber's hypothesis with a purified bacterial restriction enzyme and showed that this enzyme cuts DNA in the middle of a specific symmetrical sequence. Other restriction enzymes have similar properties, but different enzymes recognize different sequences.
限制酶识别的序列
1．限制酶识别序列的长度 限制酶识别序列的长度一般为 4-8 个碱基，最常见的为 6 个碱基。当识别序列为 4 个和 6 个碱基时，它们可识别的序列在完全随机的情况下，平均每 256 个和 4096 个碱 基中会出现一个识别位点（44=256，46=4096）。以下是几个有代表性的种类，箭头指切 割位置。 4 个碱基识别位点：Sau3AⅠ ↓GATC 5 个碱基识别位点：EcoRⅡ ↓CCWGG NciⅠ CC↓SGG 6 个碱基识别位点：EcoRⅠ G↓AATTC HindⅢ A↓AGCTT 7 个碱基识别位点：BbvCⅠ CC↓TCAGC PpuMⅠ RG↓GWCCY 8 个碱基识别位点：NotⅠ GC↓GGCCGC SfiⅠ GGCCNNNN↓NGGCC 以上序列中部分字母代表的碱基如下： R=A 或 G Y=C 或 T M=A 或 C K=G 或 T S=C 或 G W=A 或 T H=A 或 C 或 T B=C 或 G 或 T V=A 或 C 或 G D=A 或 G 或 T N=A 或 C 或 G 或 T
第2章 工具酶
大肠杆菌（Escherichia coli）用Eco表示； 流感嗜血菌（Haemophilus influenzae）用Hin表示。
2. 用一个右下标的大写字母表示菌株或型。
如Ecok, EcoR（现在都写成平行，如EcoRI）。
3. 如果一种特殊的寄主菌内有几种不同的限制与修复系统， 用罗马字母表示。
1.2 限制-修饰系统的类型与特点
1.2.1 I型限制－修饰系统
一种酶，由3个分别行使切割、甲基化和识别序列的亚基构成。 首先由M.Meselson等在1968年从大肠杆菌 K株分离：EcoK
（1）识别位点序列: 未甲基化修饰的特异序列
EcoB： TGA(N)8TGCT
EcoK：AAC(N)6GTGC
（1）I型： 单酶3亚基，随机切割 （2）II型： 双酶，定点切割 （3）IIs型：双酶，随机切割 （4）III型：单酶2亚基，随机切割
1.3 限制性核酸内切酶简介
（2）限制性核酸内切酶的定义
简称限制酶，是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列（多 为4-8bp），并由此处(或在此处附近）切割DNA双链的核酸内切酶。
主要内容
第一节 限制-修饰系统及限制性核酸内切酶
1.1 限制-修饰系统的发现及原理 1.2 限制-修饰系统类型及特点 1.3 限制性内切酶简介 1.4 基因工程中对宿主限制修饰的要求
（1）识别位点序列: 未甲基化修饰的双链DNA上的特殊靶序列（一般为
回文序列），与DNA的来源无关。
回文序列(Palindrome)：双链DNA中的一段反向重复序列，当该序列的双链 被打开后，可形成发夹结构。或者说其序列具有中心对称的特点，或者两条 单链从同一方向（5‘或3’)读时具有相同序列。
2. 用一个右下标的大写字母表示菌株或型。
如Ecok, EcoR（现在都写成平行，如EcoRI）。
3. 如果一种特殊的寄主菌内有几种不同的限制与修复系统， 用罗马字母表示。
1.2 限制-修饰系统的类型与特点
1.2.1 I型限制－修饰系统
一种酶，由3个分别行使切割、甲基化和识别序列的亚基构成。 首先由M.Meselson等在1968年从大肠杆菌 K株分离：EcoK
（1）识别位点序列: 未甲基化修饰的特异序列
EcoB： TGA(N)8TGCT
EcoK：AAC(N)6GTGC
（1）I型： 单酶3亚基，随机切割 （2）II型： 双酶，定点切割 （3）IIs型：双酶，随机切割 （4）III型：单酶2亚基，随机切割
1.3 限制性核酸内切酶简介
（2）限制性核酸内切酶的定义
简称限制酶，是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列（多 为4-8bp），并由此处(或在此处附近）切割DNA双链的核酸内切酶。
主要内容
第一节 限制-修饰系统及限制性核酸内切酶
1.1 限制-修饰系统的发现及原理 1.2 限制-修饰系统类型及特点 1.3 限制性内切酶简介 1.4 基因工程中对宿主限制修饰的要求
（1）识别位点序列: 未甲基化修饰的双链DNA上的特殊靶序列（一般为
回文序列），与DNA的来源无关。
回文序列(Palindrome)：双链DNA中的一段反向重复序列，当该序列的双链 被打开后，可形成发夹结构。或者说其序列具有中心对称的特点，或者两条 单链从同一方向（5‘或3’)读时具有相同序列。
生物化学第十章酶的作用机制和酶的调节演示课件
频率最高的活性中心的氨基酸残基：Ser、His、Cys、 Tyr、Asp、Glu、Lys。
不需要辅酶的酶：活性中心是酶分子在三维结构上比较 靠近的少数几个氨基酸残基或是这些残基的某些基团。
需要辅酶的酶：辅酶分子或辅酶分子的某一部分结构往
往就是活性中心的组成部分。
2006-1-7
2
2006-1-7
接触残基：R1、R2、R6、 R8、R9、R163 辅助残基：R3、R4、R5、 R164、R165 结 构 残 基 ： R10 、 R162 、 R169 非贡献残基：其它
2006-1-7
15
（六）多元催化和协同效应
在酶催化反应中，常常是几个基元催化反应配合在一 起共同起作用。
2006-1-7
16
（七）活性部位微环境的影响
⑴ 疏水环境 介电常数低，加强极性基团间的作用。
⑵电荷环境 在酶活性中心附近，往往有一电荷离子，可稳定过渡 态的离子
2006-1-7
17
四、酶催化反应机制的实例
2006-1-7
8
邻近效应与定向效应对反应速度的影响： ①使底物浓度在活性中心附近很高 ②酶对底物分子的电子轨道具有导向作用 ③酶使分子间反应转变成分子内反应 ④邻近效应和定向效应对底物起固定作用
2006-1-7
9
（二）底物的形变和诱导契合
酶中某些基团可使底物分子的敏感键中某些基团的电子云 密度变化，产生电子张力，降低了底物的活化能。
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三、影响酶催化效率的有关因素
（一）底物和酶的邻近效应与定向效应
邻近效应：酶与底物形成中间复合物后使底物之间、酶 的催化基团与底物之间相互靠近，提高了反应基团的有 效浓度。
酶动力学及抑制剂第二讲1-18
二次作图
双倒数作图的斜率对[I]作图为直线，此 二次作图的斜率为Km/VmKis，Y截距为 Km/Vm。以二次作图的Y截距除斜率可得 Kis。
双倒数作图的Y截距对[I]作图为直线，此 二次作图的斜率为1/VmKii，Y截距为 1/Vm。以二次作图的Y截距除斜率可得 Kii。
小结
1）在可逆抑制剂存在时，固定[I]后，双倒 数作图为直线。
5.一般非竞争性抑制(混合型)
公式：
Kis < Kii <∞ , 为竞争性和非竞争性混 合型抑制。 Kii < Kis <∞ , 为反竞争性和非竞争性 混合型抑制。
公式：
双倒数作图
竞争性和非竞争性混合，直线交于第二象限：
斜率：
Y截距：
双倒数作图
反竞争性和非竞争性混合，直线交于第三象限：
斜率：
Y截距：
1）变化底物：选定底物（考察竞争性的）。 按双倒数作图实验要求设计底物浓度。
2）选定3－5个抑制剂浓度，最小可以是0， 最大可以在抑制程度50％－70％的浓度，其 它均匀分布其间。
3）以抑制剂浓度为固定变化，测定不同底 物浓度的反应速度。注意抑制剂是直接加到 测活溶液中再加酶启动反应的。
4）操作注意点和双底物动力学实验相同。
导出[ES]/[ET]表达式
得到 v/Vm 公式
以Km 代Ks
比较 米氏 公式
(2-4)
三、抑制剂和底物的几种竞争关系
1. 概念
抑制剂和底物的竞争关系可提供有关它们在酶上 的作用以及酶的活性部位的重要信息。
竞争性抑制示意图
反竞争性抑制示意图
非竞争性抑制示意图
2. 竞争性抑制
双倒数作图
二次作图
斜率对[I]作图为直线，此二次作图的斜率 为Km/VmKi，Y截距为Km/Vm。以二次作图 的Y截距除斜率可得Ki。
限制性酶的反应系统PPT共23页
44、卓越的人一大优点是：在不利与艰 难的遭遇里百折不饶。——贝多芬
45、自己的饭量自己知道。——源自联60、人民的幸福是至高无个的法。— —西塞 罗
41、学问是异常珍贵的东西，从任何源泉吸 收都不可耻。——阿卜·日·法拉兹
42、只有在人群中间，才能认识自 己。——德国
43、重复别人所说的话，只需要教育； 而要挑战别人所说的话，则需要头脑。—— 玛丽·佩蒂博恩·普尔
限制性酶的反应系统
56、极端的法规，就是极端的不公。 ——西 塞罗 57、法律一旦成为人们的需要，人们 就不再 配享受 自由了 。—— 毕达哥 拉斯 58、法律规定的惩罚不是为了私人的 利益， 而是为 了公共 的利益 ；一部 分靠有 害的强 制，一 部分靠 榜样的 效力。 ——格 老秀斯 59、假如没有法律他们会更快乐的话 ，那么 法律作 为一件 无用之 物自己 就会消 灭。— —洛克
45、自己的饭量自己知道。——源自联60、人民的幸福是至高无个的法。— —西塞 罗
41、学问是异常珍贵的东西，从任何源泉吸 收都不可耻。——阿卜·日·法拉兹
42、只有在人群中间，才能认识自 己。——德国
43、重复别人所说的话，只需要教育； 而要挑战别人所说的话，则需要头脑。—— 玛丽·佩蒂博恩·普尔
限制性酶的反应系统
56、极端的法规，就是极端的不公。 ——西 塞罗 57、法律一旦成为人们的需要，人们 就不再 配享受 自由了 。—— 毕达哥 拉斯 58、法律规定的惩罚不是为了私人的 利益， 而是为 了公共 的利益 ；一部 分靠有 害的强 制，一 部分靠 榜样的 效力。 ——格 老秀斯 59、假如没有法律他们会更快乐的话 ，那么 法律作 为一件 无用之 物自己 就会消 灭。— —洛克
2 第二讲(2) 限制性酶的反应系统
原因： 甘油浓度高 酶过量 离子强度低 加有机溶剂（DMSO） 用别的二价离子 一般用Mg2+ PH不适合 解决措施：》》》》》》》》
Zn2+
具有星反应的限制性内切酶与条件
限制酶 AvaI BamHI BstI BsuI EcoRI HaeⅢ HhaI HindⅢ HpaI PstI PvuⅡ SalI ScaI SstⅡ XbaI 诱发星活性的条件a 1, 2, 4 1 - 5, 8 2, 4 2, 4, 6 1, 2, 4 - 6 2, 4 2, 4, 7 6 1, 2, 4 1, 2, 4, 7 2, 4 1, 2, 4, 7 4 - 6, 8 2, 4 2, 4, 7
1.1.3 识别序列的侧面序列 特例：SalI和SpeI等限制酶的识别序列两 侧不加 “保护” 核苷酸，同样可以被识别和 切割。
1限制性酶的反应系统
1.2 位点偏爱(site preferences)
某些限制酶对同一底物中的有些位点表现 出偏爱性切割，即对不同位置的同一个识别序 列表现出不同的切割效率。
最适温度
100
80
Relative Activity (%)
60
40
20
0 10 20 30 40 50 60
O
70
80
90
Temperature C
1限制性酶的反应系统
1.6 反应时间 一般为1h或更多。许多酶延长反应时间， 可以减少酶的用量。 例：EcoRI 若反应时间为16h，则所用酶 量为只酶切1h的1/8.
1限制性酶的反应系统
1.1.3 识别序列的侧面序列 在PCR引物设计时，若在PCR产物末端有某种限 制酶的识别序列，则处于末端的识别序列的一侧应该 有一个或几个“保护”核苷酸。
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分子克隆工具酶
——限制性酶的反应系统
限制性内切酶同其他酶类一样，反应 系统应包括酶、底物和反应缓冲液，并且 还需要合适的温度。
1限制性酶的反应系统
1.1 底物DNA 限制酶的底物是dsDNA分子（或其片段）， 作用位点在识别序列上。 1.1.1 DNA样品纯度 在样品中，若含有蛋白质，或没有去干净制 备过程中所用的乙醇、EDTA、SDS、酚、氯 仿等，均会降低限制酶的催化活性，甚至酶不 起作用。
1限制性酶的反应系统
1.1.3 识别序列的侧面序列 在PCR引物设计时，若在PCR产物末端有某种限 制酶的识别序列，则处于末端的识别序列的一侧应该 有一个或几个“保护”核苷酸。
SphI 5’GCATCCAAGGATCCGAC3’ 5’GGGCATCCAAGGATCCGAC3’
1限制性酶的反应系统
1限制性酶的反应系统
1.7 酶量 反应系统中酶量取决于酶本身的催化活性 和底物DNA样品。 1.7.1 酶活性 1.7.2 底物DNA 限制酶有效作用的不是DNA分子的全序列， 而是其中特定的识别序列。
1限制性酶的反应系统
1.8 star activity
限制酶识别和切割特异性位点是在特定 的条件下进行的，当条件改变时，许多酶的 识别位点会改变，导致识别与切割序列的非 特异性。
1.1.3 识别序列的侧面序列 特例：SalI和SpeI等限制酶的识别序列两 侧不加 “保护” 核苷酸，同样可以被识别和 切割。
1限制性酶的反应系统
1.2 位点偏爱(site preferences)
某些限制酶对同一底物中的有些位点表现 出偏爱性切割，即对不同位置的同一个识别序 列表现出不同的切割效率。
最适温度
100
80
Relative Activity (%)
60
40
20
0 10 20 30 40 50 60
O
70
80
90
Temperature C
1限制性酶的反应系统
1.6 反应时间 一般为1h或更多。许多酶延长反应时间， 可以减少酶的用量。 例：EcoRI 若反应时间为16h1.2 DNA分子构型 限制酶切割线性分子的效率明显高于切割 超螺旋质粒DNA和环状病毒DNA的效率。
1限制性酶的反应系统
1.1.3 识别序列的侧面序列 大多数限制酶对只含识别序列的寡核苷酸 是不具有催化活性的。 例：EcoR I GAATTC 解决方法：在识别序列两侧加适当碱基。 GGAATTCC 只有加适当碱基，才能达到正常的切割效率。
1.4.2 Mg2+ 酶活性中心，由氯化镁提供 1.4.3 DTT 提供一定的还原能力，促进连 接反应有效进行。 1.4.4 BSA（小牛血清清蛋白） 稳定剂， 有些酶在低浓度下不稳定或活性低，加入 BSA后提高活力。
1限制性酶的反应系统
1.5 反应温度 一般是37℃
• 一方面是温度升高, 酶促反应速度加快。 • 另一方面,温度升高, 酶的高级结构将发 生变化或变性，导 致酶活性降低甚至 丧失。 • 因此大多数酶都有 一个最适温度。 在 最适温度条件下,反 应速度最大。
原因： 甘油浓度高 酶过量 离子强度低 加有机溶剂（DMSO） 用别的二价离子 一般用Mg2+ PH不适合 解决措施：》》》》》》》》
Zn2+
具有星反应的限制性内切酶与条件
限制酶 AvaI BamHI BstI BsuI EcoRI HaeⅢ HhaI HindⅢ HpaI PstI PvuⅡ SalI ScaI SstⅡ XbaI 诱发星活性的条件a 1, 2, 4 1 - 5, 8 2, 4 2, 4, 6 1, 2, 4 - 6 2, 4 2, 4, 7 6 1, 2, 4 1, 2, 4, 7 2, 4 1, 2, 4, 7 4 - 6, 8 2, 4 2, 4, 7
1限制性酶的反应系统
1.3 DNA甲基化
限制酶作用：降解外源DNA，从而阻止其 复制和整合到细胞中。 甲基化酶作用：对自身某个碱基进行甲基 化，从而保护自身DNA不被降解。 一旦在识别序列中的核苷酸被甲基化，就 会影响酶切的效率。
1限制性酶的反应系统
1.4 反应缓冲液 反应缓冲液中应含有氯化镁或醋酸镁、氯化 钠或醋酸钾、二硫苏糖醇（DTT)或巯基乙醇、 Tris（三羟甲基氨基甲烷 ）—HCL或Tris—Ac. 1.4.1 PH值 7.0—7.9
a.1：亚乙二醇(45%)；2:甘油(12%)；3：乙醇(12%)；4：高酶/DNA比(>25U/μ g)；
5：Mn++代替Mg++；6:pH8.5; 7:二甲基亚砜(8%); 8:无NaCl。
思考题： 影响限制酶反应的因子有哪些？
不仅侧面序列长短与限制酶的切割效率有 关，而且侧面序列的核苷酸组成与切割效率也 有关。
在pBR322中，NaeI 有4个识别序列，位置 分布在：403、771、931和1285处。 一般情况下，403和771可迅速被 NaeI切割， 931稍微慢些，而位于1285处的识别序列，切 割效率只有其他的1/15.
——限制性酶的反应系统
限制性内切酶同其他酶类一样，反应 系统应包括酶、底物和反应缓冲液，并且 还需要合适的温度。
1限制性酶的反应系统
1.1 底物DNA 限制酶的底物是dsDNA分子（或其片段）， 作用位点在识别序列上。 1.1.1 DNA样品纯度 在样品中，若含有蛋白质，或没有去干净制 备过程中所用的乙醇、EDTA、SDS、酚、氯 仿等，均会降低限制酶的催化活性，甚至酶不 起作用。
1限制性酶的反应系统
1.1.3 识别序列的侧面序列 在PCR引物设计时，若在PCR产物末端有某种限 制酶的识别序列，则处于末端的识别序列的一侧应该 有一个或几个“保护”核苷酸。
SphI 5’GCATCCAAGGATCCGAC3’ 5’GGGCATCCAAGGATCCGAC3’
1限制性酶的反应系统
1限制性酶的反应系统
1.7 酶量 反应系统中酶量取决于酶本身的催化活性 和底物DNA样品。 1.7.1 酶活性 1.7.2 底物DNA 限制酶有效作用的不是DNA分子的全序列， 而是其中特定的识别序列。
1限制性酶的反应系统
1.8 star activity
限制酶识别和切割特异性位点是在特定 的条件下进行的，当条件改变时，许多酶的 识别位点会改变，导致识别与切割序列的非 特异性。
1.1.3 识别序列的侧面序列 特例：SalI和SpeI等限制酶的识别序列两 侧不加 “保护” 核苷酸，同样可以被识别和 切割。
1限制性酶的反应系统
1.2 位点偏爱(site preferences)
某些限制酶对同一底物中的有些位点表现 出偏爱性切割，即对不同位置的同一个识别序 列表现出不同的切割效率。
最适温度
100
80
Relative Activity (%)
60
40
20
0 10 20 30 40 50 60
O
70
80
90
Temperature C
1限制性酶的反应系统
1.6 反应时间 一般为1h或更多。许多酶延长反应时间， 可以减少酶的用量。 例：EcoRI 若反应时间为16h1.2 DNA分子构型 限制酶切割线性分子的效率明显高于切割 超螺旋质粒DNA和环状病毒DNA的效率。
1限制性酶的反应系统
1.1.3 识别序列的侧面序列 大多数限制酶对只含识别序列的寡核苷酸 是不具有催化活性的。 例：EcoR I GAATTC 解决方法：在识别序列两侧加适当碱基。 GGAATTCC 只有加适当碱基，才能达到正常的切割效率。
1.4.2 Mg2+ 酶活性中心，由氯化镁提供 1.4.3 DTT 提供一定的还原能力，促进连 接反应有效进行。 1.4.4 BSA（小牛血清清蛋白） 稳定剂， 有些酶在低浓度下不稳定或活性低，加入 BSA后提高活力。
1限制性酶的反应系统
1.5 反应温度 一般是37℃
• 一方面是温度升高, 酶促反应速度加快。 • 另一方面,温度升高, 酶的高级结构将发 生变化或变性，导 致酶活性降低甚至 丧失。 • 因此大多数酶都有 一个最适温度。 在 最适温度条件下,反 应速度最大。
原因： 甘油浓度高 酶过量 离子强度低 加有机溶剂（DMSO） 用别的二价离子 一般用Mg2+ PH不适合 解决措施：》》》》》》》》
Zn2+
具有星反应的限制性内切酶与条件
限制酶 AvaI BamHI BstI BsuI EcoRI HaeⅢ HhaI HindⅢ HpaI PstI PvuⅡ SalI ScaI SstⅡ XbaI 诱发星活性的条件a 1, 2, 4 1 - 5, 8 2, 4 2, 4, 6 1, 2, 4 - 6 2, 4 2, 4, 7 6 1, 2, 4 1, 2, 4, 7 2, 4 1, 2, 4, 7 4 - 6, 8 2, 4 2, 4, 7
1限制性酶的反应系统
1.3 DNA甲基化
限制酶作用：降解外源DNA，从而阻止其 复制和整合到细胞中。 甲基化酶作用：对自身某个碱基进行甲基 化，从而保护自身DNA不被降解。 一旦在识别序列中的核苷酸被甲基化，就 会影响酶切的效率。
1限制性酶的反应系统
1.4 反应缓冲液 反应缓冲液中应含有氯化镁或醋酸镁、氯化 钠或醋酸钾、二硫苏糖醇（DTT)或巯基乙醇、 Tris（三羟甲基氨基甲烷 ）—HCL或Tris—Ac. 1.4.1 PH值 7.0—7.9
a.1：亚乙二醇(45%)；2:甘油(12%)；3：乙醇(12%)；4：高酶/DNA比(>25U/μ g)；
5：Mn++代替Mg++；6:pH8.5; 7:二甲基亚砜(8%); 8:无NaCl。
思考题： 影响限制酶反应的因子有哪些？
不仅侧面序列长短与限制酶的切割效率有 关，而且侧面序列的核苷酸组成与切割效率也 有关。
在pBR322中，NaeI 有4个识别序列，位置 分布在：403、771、931和1285处。 一般情况下，403和771可迅速被 NaeI切割， 931稍微慢些，而位于1285处的识别序列，切 割效率只有其他的1/15.