2 第二讲(2) 限制性酶的反应系统

原因： 甘油浓度高 酶过量 离子强度低 加有机溶剂（DMSO） 用别的二价离子 一般用Mg2+ PH不适合 解决措施：》》》》》》》》
Zn2+
具有星反应的限制性内切酶与条件
限制酶 AvaI BamHI BstI BsuI EcoRI HaeⅢ HhaI HindⅢ HpaI PstI PvuⅡ SalI ScaI SstⅡ XbaI 诱发星活性的条件a 1, 2, 4 1 - 5, 8 2, 4 2, 4, 6 1, 2, 4 - 6 2, 4 2, 4, 7 6 1, 2, 4 1, 2, 4, 7 2, 4 1, 2, 4, 7 4 - 6, 8 2, 4 2, 4, 7
1.4.2 Mg2+ 酶活性中心，由氯化镁提供 1.4.3 DTT 提供一定的还原能力，促进连 接反应有效进行。 1.4.4 BSA（小牛血清清蛋白） 稳定剂， 有些酶在低浓度下不稳定或活性低，加入 BSA后提高活力。
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1.5 反应温度 一般是37℃
• 一方面是温度升高, 酶促反应速度加快。 • 另一方面,温度升高, 酶的高级结构将发 生变化或变性，导 致酶活性降低甚至 丧失。 • 因此大多数酶都有 一个最适温度。 在 最适温度条件下,反 应速度最大。
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1.7 酶量 反应系统中酶量取决于酶本身的催化活性 和底物DNA样品。 1.7.1 酶活性 1.7.2 底物DNA 限制酶有效作用的不是DNA分子的全序列， 而是其中特定的识别序列。
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1.8 star activity
限制酶识别和切割特异性位点是在特定 的条件下进行的，当条件改变时，许多酶的 识别位点会改变，导致识别与切割序列的非 特异性。
最适温度
100
80
Relative Activity (%)
60
40
20
0 10 20 30 40 50 60
O
70
80
90
Temperature C
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1.6 反应时间 一般为1h或更多。许多酶延长反应时间， 可以减少酶的用量。 例：EcoRI 若反应时间为16h，则所用酶 量为只酶切1h的1/8.
不仅侧面序列长短与限制酶的切割效率有 关，而且侧面序列的核苷酸组成与切割效率也 有关。
在pBR322中，NaeI 有4个识别序列，位置 分布在：403、771、931和1285处。 一般情况下，403和771可迅速被 NaeI切割， 931稍微慢些，而位于1285处的识别序列，切 割效率只有其他的1/15.
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1.3 DNA甲基化
限制酶作用：降解外源DNA，从而阻止其 复制和整合到细胞中。 甲基化酶作用：对自身某个碱基进行甲基 化，从而保护自身DNA不被降解。 一旦在识别序列中的核苷酸被甲基化，就 会影响酶切的效率。
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1.4 反应缓冲液 反应缓冲液中应含有氯化镁或醋酸镁、氯化 钠或醋酸钾、二硫苏糖醇（DTT)或巯基乙醇、 Tris（三羟甲基氨基甲烷 ）—HCL或Tris—Ac. 1.4.1 PH值 7.0—7.9
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1.1.2 DNA分子构型 限制酶切割线性分子的效率明显高于切割 超螺旋质粒DNA和环状病毒DNA的效率。
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1.1.3 识别序列的侧面序列 大多数限制酶对只含识别序列的寡核苷酸 是不具有催化活性的。 例：EcoR I GAATTC 解决方法：在识别序列两侧加适当碱基。 GGAATTCC 只有加适当碱基，才能达到正常的切割效率。
a.1：亚乙二醇(45%)；2:甘油(12%)；3：乙醇(12%)；4：高酶/DNA比(>25U/μ g)；
5：Mn++代替Mg++；6:pH8.5; 7:二甲基亚砜(8%); 8:无NaCl。
思考题： 影响限制酶反应的因子有哪些？
分子克隆工具酶
——限制性酶的反应系统
限制性内切酶同其他酶类一样，反应 系统应包括酶、底物和反应缓冲液，并且 还需要合适的温度。
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1.1 底物DNA 限制酶的底物是dsDNA分子（或其片段）， 作用位点在识别序列上。 1.1.1 DNA样品纯度 在样品中，若含有蛋白质，或没有去干净制 备过程中所用的乙醇、EDTA、SDS、酚、氯 仿等，均会降低限制酶的催化活性，甚至酶不 起作用。
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1.1.3 识别序列的侧面序列 在PCR引物设计时，若在PCR产物末端有某种限 制酶的识别序列，则处于末端的识别序列的一侧应该 有一个或几个“保护”核苷酸。
SphI 5’GCATCCAAGGATCCGAC3’ 5’GGGCATCCAAGGATCCGAC3’
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1.1.3 识别序列的侧面序列 特例：SalI和SpeI等限制酶的识别序列两 侧不加 “保护” 核苷酸，同样可以被识别和 切割。
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1.2 位点偏爱(site preferences)
某些限制酶对同一底物中的有些位点表现 出偏爱性切割，即对不同位置的同一个识别序 列表现出不同的切割效率。