分子生物学实验总结

分子生物学实验

1.TOMY全自动灭菌锅的使用

（1）检查排放蒸汽的水壶，腔体内的水位与托板齐平。

（2）SET键设置温度和时间（121℃，20min）

（3）关闭排气阀，Start机器开始运行，Check Heat检查设置的温度，Stop键终止机器运行。（4）程序运行结束，旋开排气阀或机器自行排气至压力为0。温度降至80℃以下压力为0时方可开盖。运行过程中勿接触盖子。

（5）腔体内经常清洁。

2.LB液体培养基（1000mL）

将胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g完全溶解在950mL去离子水中，用NaOH调节pH至7.0，加入去离子水至总体积为1000mL，121℃湿热灭菌20min。冷却后4℃保存备用。固体还要再加琼脂。

3.碱裂解法

碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们的。在pH值介于12.0～12.5这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭合环状质粒DNA的氢键会断裂，但两条互补链彼此缠绕，仍会紧密的结合在一起。当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液，恢复pH至中性时，共价闭合环状质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们缠绕形成网状结构。通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质－SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。

溶液Ⅰ：葡萄糖，Tris-HCl，EDTA 葡萄糖能增加溶液的黏度，防止DNA受机械作用而降解。EDTA可螯合Mg2+、Ca2+等金属离子，抑制DNase对DNA的降解作用。

溶液Ⅱ：氢氧化钠，SDS 氢氧化钠加入后碱性环境12-12.5促使染色体DNA与质粒的变性解离成单链。SDS是一种阴离子去垢剂，它的主要作用有：①溶解细胞膜上的脂肪与蛋白，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜；②解聚细胞中的核蛋白，使蛋白质与DNA分开；③SDS能与蛋白质结合成为SDS-蛋白质复合物，使蛋白质变性而沉淀；④SDS能抑制核酸酶的作用，防止对DNA的降解。

溶液Ⅲ：乙酸钾。用pH4.2的KAc溶液是为了调整溶液pH至中性，使变性的质粒DNA能够复性，并能稳定存在。而高盐的3mol/L醋酸钾(KAc)有利于变性的大分子染色体DNA、RNA 以及SDS-蛋白质复合物凝聚而沉淀。

4.loading buffer

电泳指示剂溴酚兰在碱性液体中呈紫兰色，一般与蔗糖、甘油组成上样缓冲液。作用：①增加样品比重，以确保DNA均匀沉入加样孔内。②形成肉眼可见的指示带，预测核酸电泳的速度和位置。③使样品呈色，使加样操作更方便。

5.限制性内切酶

（I型）限制性内切酶：能识别专一的核苷酸顺序，并在识别点附近的一些核苷酸上切割DNA 分子中的双链，但是切割的核苷酸顺序没有专一性，是随机的。

(II型)限制性内切酶：能识别专一的核苷酸顺序，并在该顺序内的固定位置上切割双链。这类限制性内切酶的识别和切割的核苷酸都是专一的，因此，这种限制性内切酶是DNA重组技术中最常用的工具酶之一。

（III型）限制性内切酶：也有专一的识别顺序，但不是对称的回文顺序,在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。但这几个核苷酸对不是特异性的。因此，这种限制性内切酶切割后产生的一定长度DNA片段，具有各种单链末端。因此不能应用于基因克隆。6.引物设计和选择目的DNA序列区域时遵循下列原则：

引物长度约为16～30bp；引物中G+C含量通常为40%～60%，可按Tm＝4(G+C)+2(A+T)粗略估计引物的解链温度；四种碱基应随机分布，在3’端不存在连续3个G或C，因这样易导致错误；引物3’端最好与目的序列阅读框架中密码子第一或第二位核苷酸对应，以减少由于密码子摆动产生的不配对；在引物内，尤其在3’端应不存在二级结构；两引物之间尤其在3’端不能互补，以防出现引物二聚体，减少产量；引物5’端对扩增特异性影响不大，可引入酶切位点或突变位点；引物不与模板结合位点以外的序列互补；简并引物应选用简并程度低的密码子；引物的浓度一般为0.1～0.5μmol/L，引物浓度偏高会引起错配和非特异性产物扩增，引物浓度偏低则降低产量。

7.dNTP

常用的浓度为20～200μmol/L，而且4种dNTP的终浓度相等，以减少合成中由于某种dNTP 的不足而出现的错误掺入；dNTP浓度过高虽可加快反应速度，但会增加碱基的错误掺入率，同时会抑制Taq DNA聚合酶的反应活性；适当的低浓度会提高反应的精确度；注意协调Mg2+浓度和dNTP浓度之间的关系。

8.感受态

处于对数生长期的细菌经低温CaCl2处理后接受外源DNA的能力显著增加。细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。在自然条件下，很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内，但在人工构建的质粒载体中，一般缺乏此种转移所必需的mob 基因，因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态,以摄取外源DNA。

9.转化

转化是将外源DNA 分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段。转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(R-,M-)，它可以容忍外源DNA 分子进入体内并稳定地遗传给后代。它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。

10.DNA连接酶

有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶；DNA重组的方法主要有粘端连接法和平端连接法，为了防止载体本身的自连，可以通过牛小肠碱性磷酸酶CIP处理克服；连接反应的温度在37℃时有利于连接酶的活性。但是在这个温度下，粘性末端的氢键结合是不稳定的。因此人们找到了一个折中的温度，即12～16℃，连接12～16h（过夜），这样既可最大限度地发挥连接酶的活性，又兼顾到短暂配对结构的稳定；

pMD18-T Vector 是一种高效克隆PCR 产物（TA Cloning）的专用载体，该载体由pUC18 载体改建并在其3’端添加“T”而成

大部分耐热性DNA聚合酶进行PCR反应时都有在PCR产物的3’末端添加一个“A”的特性，所以使用本制品可以大大提高PCR产物的连接、克隆效率；

转化是指质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程

11.α互补

重组质粒转化宿主细胞后，还需对转化菌落进行筛选鉴定。利用α互补现象进行筛选是最常用的一种鉴定方法；α互补：质粒载体上lacZ’基因编码的α肽段与失去了正常氨基端的β-半乳糖苷酶突变受体菌之间实现互补的现象，由α互补而形成的有功能活性的β半乳糖苷酶，可以用Xgal显色测定出来；任何携带着lacZ’基因的质粒载体在转化β半乳糖苷酶突变的大肠杆菌细胞后，在含有Xgal的培养基平板上形成蓝色菌落，而含有重组质粒载体的克隆往往是白色菌落。