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细胞生物学
(六)荧光漂白恢复技术
FRAP (光漂白后荧光恢复)就是在光漂白后对样本确定 区中的荧光恢复。FRAP是由没有漂白的荧光团由周围进 入漂白区FRAP的运动引起的。FRAP用于测量2-维或3-维 分子运动的力度。分子运动包括膜或活细胞内用荧光标 明的分子的扩散、转移或其他类型的运动。
细胞生物学
细胞生物学
细胞生物学
细胞生物学
2、负染技术
用重金属盐(如磷 钨酸)对铺展在载 网上的样品染色； 吸去染料，干燥 后，样品凹陷处 铺了一层重金属 盐，而凸的出地 方没有染料沉积， 从而出现负染效 果，分辨力可达 1.5nm左右。
Negative Stained Actin
1、环形光阑（annular diaphragm）：位于光 源与聚光器之间。
2、相位板（annular phaseplate）：物镜中加 了涂有氟化镁的相位板，可将直射光或衍射 光的相位推迟1/4λ。
细胞生物学
细胞生物学
用途：观察未经染色的玻片标本
细胞生物学
微分干涉显微镜
1952年，Nomarski发明，微分干涉 显微镜是以平面偏振光为光源，光 线经棱镜折射后分成两束，在不同 时间经过样品的相邻部位，然后经 过另一棱镜将这两束光汇合，从而 样品中厚度上的微小差别就会转化 成明暗区别，增加了样品反差，造 成了标本的人为三维立体感，类似 大理石上的浮雕。 微分干涉显微 镜适于研究活细胞中较大的细胞器， 如果接上录像装置可以记录活细胞 中的颗粒以及细胞器的运动。
细胞生物学
（二）相差和微分干涉显微技术 干涉:两列频率相同的光波在 空中相遇时发生叠加，在某些 区域总加强，在另外一些区域 总减弱，出现明暗相间的条纹 或者是彩色条纹的现象叫做光 的干涉。
细胞生物学
相差显微镜 把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从 而提高了各种结构间的对比度，使各种结构 变得清晰可见。在构造上，相差显微镜有不 同于普通光学显微镜两个特殊之处。
(五)荧光共振能量转移技术
CFP的发射光谱与YFP的吸收光谱有相当的重 叠，当它们足够接近时，用CFP的吸收波长激 发，CFP的发色基团将会把能量高效率地共振转 移至YFP的发色基团上，所以CFP的发射荧光将 减弱或消失，主要发射将是YFP的荧光。
细胞生物学
细胞生物学
应用: 1、检测酶活性变化 2、关于膜蛋白的研究 3、细胞膜受体之间相互作用 4、细胞内分子之间相互作用
细胞生物学
（二）、主要电镜制样技术介绍 1、超薄切片技术 电子束穿透力很弱，用于电镜观察的标本须制成厚 度仅40-50nm的超薄切片， (1)固定：通常以锇酸和戊二醛固定样品，丙酮逐级脱水 (2)包埋：环氧树脂包埋 (3)切片：以热膨胀或螺旋推进的方式切片 (4)染色：重金属（铀、铅）盐染色形成明暗的黑白图象
细胞生物学
laser confocal scanning microscope, LCSM
细胞生物学
细胞生物学
LCSM Image of a Xenopus Melanophore
microtubule cytoskeleton (green) and the nucleus (blue)
细胞生物学
第三章 细胞生物学实验技术
细胞生物学
第一节 细胞形态结构的观察方法
一、光学显微镜 二、电子显微镜 三、扫描隧道显微镜
第二节 细胞组分的分析方法
一、用超速离心技术分离细胞器与生物大分子及其复合物 二、细胞内核酸、蛋白质、糖与脂质等成分的显示方法 三、特异蛋白抗原的定位与定性 四、细胞内特异核酸序列的定位与定性 五、应用放射自显影技术研究生物大分子在细胞内的合成动态 六、定量细胞化学分析技术
第三节 细胞培养、细胞工程与显微操作技术
一、细胞培养 二、细胞工程
第四节 用于细胞生物学研究的模式生物
细胞生Βιβλιοθήκη Baidu学
第一节 细胞形态结构的观察方法
•光学显微镜：以可见光（或紫外线）为光源。 •电子显微镜：以电子束为光源。
细胞生物学
一、光学显微镜
（一）普通光学显微镜
1、构成： ①照明系统 ②光学放大系统 ③机械装置
细胞生物学
（三）荧光显微镜
特点：光源为紫外线，波 长较短，分辨力高于普通 显微镜； 有两个特殊的滤光片； 照明方式通常为落射式。
细胞生物学
细胞生物学
用于观察能激发出荧光的结构。 用途：免疫荧光观察、基因定位、疾病诊断。
Fluorescence image of
epithelial cell, DNA in
blue and Microtubules
in green
细胞生物学
（四）激光共聚焦扫描显微境 Laser confocal scanning microscope, LCSM •用激光作光源，逐点、逐行、逐面快速扫描。
•能显示细胞样品的立体结构。
•分辨力是普通光学显微镜的3倍。
•用途类似荧光显微镜，但能扫描不同层次，形 成立体图像。
二、电子 显微镜
（一）电 子显微镜 的基本知 识
1、电子 显微镜与 光学显微 镜的基本 区别
细胞生物学
不同光线的波长
细胞生物学
２、电子显微镜的分辨本领和有效放大倍数 分辨本领：是指电镜处于最佳状态下的分辨率 电镜分辨率受制样技术的影响。
细胞生物学
３、电子显微镜的基本构造 １）电子束照明系统 ２）成像系统 ３）真空系统 ４）记录系统
细胞生物学
表一、几种介质的折射率
细胞生物学
显微镜的几个光学特点：
➢制作光学镜头所用的玻璃折射率为1.65~1.78，所用介质的折 射率越接近玻璃的越好。 ➢sin α /2的最大值必然小于1；介质为空气，镜口率一般为 0.05~0.95；油镜头用香柏油为介质，镜口率可接近1.5。 ➢普通光线的波长为400~700nm，分辨力数值不会小于.2μm， 人眼的分辨力为0.2mm,因此显微镜的最大设计倍数为1000X。
2、原理：经物镜形成倒立实像，经目镜进一步放大 成像。
细胞生物学
细胞生物学
细胞生物学
3. 分辨力：指分辨物体最小间隔的能力。
R=0.61λ/N．A．其中λ为入射光线波长；N．A：
为镜口率 ＝ｎsinα/2， n=介质折射率； α=镜口角（样品对物镜镜口的张角） 。
思考：如何提高显微镜的分辨能力？
(六)荧光漂白恢复技术
FRAP (光漂白后荧光恢复)就是在光漂白后对样本确定 区中的荧光恢复。FRAP是由没有漂白的荧光团由周围进 入漂白区FRAP的运动引起的。FRAP用于测量2-维或3-维 分子运动的力度。分子运动包括膜或活细胞内用荧光标 明的分子的扩散、转移或其他类型的运动。
细胞生物学
细胞生物学
细胞生物学
细胞生物学
2、负染技术
用重金属盐(如磷 钨酸)对铺展在载 网上的样品染色； 吸去染料，干燥 后，样品凹陷处 铺了一层重金属 盐，而凸的出地 方没有染料沉积， 从而出现负染效 果，分辨力可达 1.5nm左右。
Negative Stained Actin
1、环形光阑（annular diaphragm）：位于光 源与聚光器之间。
2、相位板（annular phaseplate）：物镜中加 了涂有氟化镁的相位板，可将直射光或衍射 光的相位推迟1/4λ。
细胞生物学
细胞生物学
用途：观察未经染色的玻片标本
细胞生物学
微分干涉显微镜
1952年，Nomarski发明，微分干涉 显微镜是以平面偏振光为光源，光 线经棱镜折射后分成两束，在不同 时间经过样品的相邻部位，然后经 过另一棱镜将这两束光汇合，从而 样品中厚度上的微小差别就会转化 成明暗区别，增加了样品反差，造 成了标本的人为三维立体感，类似 大理石上的浮雕。 微分干涉显微 镜适于研究活细胞中较大的细胞器， 如果接上录像装置可以记录活细胞 中的颗粒以及细胞器的运动。
细胞生物学
（二）相差和微分干涉显微技术 干涉:两列频率相同的光波在 空中相遇时发生叠加，在某些 区域总加强，在另外一些区域 总减弱，出现明暗相间的条纹 或者是彩色条纹的现象叫做光 的干涉。
细胞生物学
相差显微镜 把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从 而提高了各种结构间的对比度，使各种结构 变得清晰可见。在构造上，相差显微镜有不 同于普通光学显微镜两个特殊之处。
(五)荧光共振能量转移技术
CFP的发射光谱与YFP的吸收光谱有相当的重 叠，当它们足够接近时，用CFP的吸收波长激 发，CFP的发色基团将会把能量高效率地共振转 移至YFP的发色基团上，所以CFP的发射荧光将 减弱或消失，主要发射将是YFP的荧光。
细胞生物学
细胞生物学
应用: 1、检测酶活性变化 2、关于膜蛋白的研究 3、细胞膜受体之间相互作用 4、细胞内分子之间相互作用
细胞生物学
（二）、主要电镜制样技术介绍 1、超薄切片技术 电子束穿透力很弱，用于电镜观察的标本须制成厚 度仅40-50nm的超薄切片， (1)固定：通常以锇酸和戊二醛固定样品，丙酮逐级脱水 (2)包埋：环氧树脂包埋 (3)切片：以热膨胀或螺旋推进的方式切片 (4)染色：重金属（铀、铅）盐染色形成明暗的黑白图象
细胞生物学
laser confocal scanning microscope, LCSM
细胞生物学
细胞生物学
LCSM Image of a Xenopus Melanophore
microtubule cytoskeleton (green) and the nucleus (blue)
细胞生物学
第三章 细胞生物学实验技术
细胞生物学
第一节 细胞形态结构的观察方法
一、光学显微镜 二、电子显微镜 三、扫描隧道显微镜
第二节 细胞组分的分析方法
一、用超速离心技术分离细胞器与生物大分子及其复合物 二、细胞内核酸、蛋白质、糖与脂质等成分的显示方法 三、特异蛋白抗原的定位与定性 四、细胞内特异核酸序列的定位与定性 五、应用放射自显影技术研究生物大分子在细胞内的合成动态 六、定量细胞化学分析技术
第三节 细胞培养、细胞工程与显微操作技术
一、细胞培养 二、细胞工程
第四节 用于细胞生物学研究的模式生物
细胞生Βιβλιοθήκη Baidu学
第一节 细胞形态结构的观察方法
•光学显微镜：以可见光（或紫外线）为光源。 •电子显微镜：以电子束为光源。
细胞生物学
一、光学显微镜
（一）普通光学显微镜
1、构成： ①照明系统 ②光学放大系统 ③机械装置
细胞生物学
（三）荧光显微镜
特点：光源为紫外线，波 长较短，分辨力高于普通 显微镜； 有两个特殊的滤光片； 照明方式通常为落射式。
细胞生物学
细胞生物学
用于观察能激发出荧光的结构。 用途：免疫荧光观察、基因定位、疾病诊断。
Fluorescence image of
epithelial cell, DNA in
blue and Microtubules
in green
细胞生物学
（四）激光共聚焦扫描显微境 Laser confocal scanning microscope, LCSM •用激光作光源，逐点、逐行、逐面快速扫描。
•能显示细胞样品的立体结构。
•分辨力是普通光学显微镜的3倍。
•用途类似荧光显微镜，但能扫描不同层次，形 成立体图像。
二、电子 显微镜
（一）电 子显微镜 的基本知 识
1、电子 显微镜与 光学显微 镜的基本 区别
细胞生物学
不同光线的波长
细胞生物学
２、电子显微镜的分辨本领和有效放大倍数 分辨本领：是指电镜处于最佳状态下的分辨率 电镜分辨率受制样技术的影响。
细胞生物学
３、电子显微镜的基本构造 １）电子束照明系统 ２）成像系统 ３）真空系统 ４）记录系统
细胞生物学
表一、几种介质的折射率
细胞生物学
显微镜的几个光学特点：
➢制作光学镜头所用的玻璃折射率为1.65~1.78，所用介质的折 射率越接近玻璃的越好。 ➢sin α /2的最大值必然小于1；介质为空气，镜口率一般为 0.05~0.95；油镜头用香柏油为介质，镜口率可接近1.5。 ➢普通光线的波长为400~700nm，分辨力数值不会小于.2μm， 人眼的分辨力为0.2mm,因此显微镜的最大设计倍数为1000X。
2、原理：经物镜形成倒立实像，经目镜进一步放大 成像。
细胞生物学
细胞生物学
细胞生物学
3. 分辨力：指分辨物体最小间隔的能力。
R=0.61λ/N．A．其中λ为入射光线波长；N．A：
为镜口率 ＝ｎsinα/2， n=介质折射率； α=镜口角（样品对物镜镜口的张角） 。
思考：如何提高显微镜的分辨能力？