植物基因转化受体系统
第五章 植物基因的遗传转化
主讲：胡银岗植物科学系农学院植物科学系西北农林科技大学农学院西北农林科技大学植物基因受体系统质粒介导基因转化直接导入的基因转化第四节花粉管通道法介导基因转化第五节病毒介导的基因转化第六节植物基因转化系统的选择第七节单子叶植物的基因转化依赖于良好的植物受体系统的建立。
用于转化的外植体（如发苗产生子叶、胚轴等）通过组织培养途径或其它非组织培养途径能高效、稳定地再生无性系接受外源DNA整合对转化选择抗生素敏感植物基因转化受体系统的条件（一）高效稳定的再生能力（二）较高的遗传稳定性（三）具有稳定的外植体来源（四）对选择性抗生素敏感（五）对农杆菌侵染有敏感性（一）高效稳定的再生能力从理论上讲，植物的任何体细胞都具有再生完整植（totipotency）但在组织培养的实践中，并不是所有的体细胞都能再生出完营养生长中心（分生组织）和薄壁细易再生出植株。
再生频率必须具有好的稳定性和重复性。
植物转化频率一般情况下只有0.1%。
基因转化操作，如农杆菌侵染，使用抗菌素筛选及继代培养，都会使转化外植体再生频率降低，有的甚至不能分化，或只能分化形成芽，而难以形成植株。
若只有10%再生率，则转化率10% ×0.1% = 0.01%后不影响其分裂和分化，并能稳定地将外源基因遗传给后代，保持遗传的稳定性，尽量减少变异。
不因导入优良性状的目的基因，使原有的目的性状（优良性状）在后代发生了变异。
注意组培过程（组培方法，再生途径及外植体基因型）引稳定的外植体来源，即外植体容易得到并且可以大量提供。
因基因转化的频率很低，需要多项反复地实验，所以就需要大量的外植体材料。
转化的外植体一般采用无菌实生苗的子叶、胚轴、幼叶等，或采用快速无需复杂的培养和繁殖操作过程，数量亦多；接种前的无菌处理简便易行；一些植物可由无菌幼苗形成愈伤组织和再生植株；无需保持无菌苗的无性系，只要有种子，随时可大量培养已适应组织培养条件，有利于外植体转化生长；可直接采用、无需消毒；材料来源量大而稳定。
细胞工程第七章 植物转化受体系统
特点：
(1) 原生质体被除去了细胞壁这一天然屏障，能够直 接高效地摄取外源DNA或遗传物质，甚至细胞核；
(2) 通过原生质体培养，细胞分裂可形成基因型一致的细胞 克隆，从转化原生质体获得的转基因植株嵌合体少；
(3) 原生质体转化受体系统易于在相对均匀和稳定 的同等控制条件下进行准确的转化和鉴定；
选择原则 ：
①同一物种的培养基有雷同性，即同一物种的不同亚种、品种间的基本培养基 类型基本相同；
②同一植物的不同组织器官的基本培养基类型基本相同； ③植物组织培养时所需营养成分与田间栽培有相似性； ④MS培养基是大多数植物的通用培养基； ⑤无机盐的浓度是基本培养基类型的重要因素，应该作为培养基选择的重要参
的抗生素有一定的敏感性；要求抗生素对受体植物 没有严重的毒性；
（5）对农杆菌侵染有敏感性。
第一节 植物基因转化受体系统的类型及其特性
一、愈伤组织再生系统
愈伤组织再生系统是指外植体经脱分化培养诱导愈伤组织，并 通过分化培养获得再生植株的受体系统。
特点：
（1）外植体细胞经历了脱分化和再分化两个过程，具有易 于接受外源基因的能力，转化率较高；
第七章 植物基因转化受体系统
本章所讲内容：
建立植物基因转化受体系统的基本条件； 植物基因转化受体系统的类型及其特性； 建立植物基因转化受体系统的程序及要求； 建立植物基因转化受体系统过程中的常见问
题及解决方案。
概述：
植物基因工程技术：即将目标性状基因分离出来， 构建重组DNA分子导入受体物种中，筛选出获得目 标基因表达后代，培育新品种，这种技术称为转化。
生理上的变化：
结构：茎尖分生细胞较小、结构简单，缺少 具正常功能的输导组织，叶片只有海绵组织， 气孔的保卫细胞功能失调等。
黄芪遗传转化受体系统的建立及aFGF转化黄芪的研究的开题报告
黄芪遗传转化受体系统的建立及aFGF转化黄芪的研究的开题报告一、研究背景黄芪是一种在中国广泛分布的中草药，具有抗疲劳、免疫调节等多种药理作用，同时也是一种重要的经济植物。
然而黄芪的种质资源较为有限，育种进展缓慢。
因此，利用遗传转化技术对黄芪进行基因改良，提高其品质和产量，具有十分重要的实际意义。
二、研究目的和意义本研究旨在建立黄芪的遗传转化受体系统，并利用该系统实现aFGF 对黄芪的遗传转化。
通过该研究，可以为黄芪的基因改良提供技术支持，促进黄芪产业的发展。
三、研究内容与方法本研究主要包括以下两个方面的内容：1. 建立黄芪的遗传转化受体系统。
采用转录组学和生物信息学技术，对黄芪的基因组进行分析，筛选与遗传转化相关的基因，构建遗传转化受体系统。
通过植物组织培养和遗传转化技术，将外源基因导入黄芪细胞中，实现遗传转化。
2. 利用aFGF对黄芪进行遗传转化。
将aFGF与遗传转化受体结合，通过逆境诱导等手段，实现aFGF对黄芪的遗传转化。
同时，对转化后的黄芪进行品质和产量的检测，评估遗传转化效果。
四、预期成果及其对黄芪产业的贡献1. 建立黄芪的遗传转化受体系统，并实现对黄芪的遗传转化；2. 评估aFGF对黄芪的遗传转化效果；3. 提高黄芪的品质和产量，促进黄芪产业的健康发展。
五、研究难点与解决方案1. 黄芪的基因组分析和遗传转化受体系统的构建；解决方案：采用转录组学和生物信息学技术，结合实验验证，筛选与遗传转化相关的基因，构建遗传转化受体系统。
2. aFGF对黄芪的遗传转化；解决方案：通过逆境诱导等手段，提高遗传转化效率。
同时，对实验条件进行优化，进一步提高遗传转化效果。
六、研究进度安排本研究计划为期三年，预期的进度安排如下：第一年：开展黄芪的基因组分析，筛选出与遗传转化相关的基因，构建遗传转化受体系统；第二年：进行遗传转化实验，优化实验条件，提高遗传转化效果；第三年：评估遗传转化效果，检测转化后黄芪的品质和产量，编写研究报告。
植物基因转化受体系统
注意问题
直接分化受体系统比较适合于无性繁殖植物 选材：从组织类型上讲，子叶、叶片、胚轴和某些
营养变态器官通常比较容易诱导；从细胞状态上讲。 薄壁细胞状态外植体较容易诱导
原生质体再生系统
原生质体由于除去了细胞壁的屏障，能够直接高效 的摄取外源DNA或遗传物质，甚至细胞核
适合于现在建立的所有转化方法
抗生素敏感性
为了便于转化子的筛选需要使用标记基因（如抗生 素抗性基因等）
选择性抗生素需满足的条件： （1）植物受体材料对所选用的抗生素具有一定的敏
感性； （2）抗生素对受体植物没有剧烈的毒性，不会很快
杀死植物细胞
对抗生素过度敏感或过度钝化的植物材料都不适合 于构建植物转基因的受体系统
不同的受体类型具有不同的缺点，适合的转化方法 也不同
实际操作中应根据受体的特性，基因转化方法，选 择适宜的受体系统
特点
外植体来源广泛 扩繁量大，可获得较多的转化植株 使用的植物范围广
从愈伤组织分化的不定芽的多细胞起源特点，形成 嵌合体较多
再生植株无性系变异较大，转化的外源基因遗传稳 定性较差
植物周倜系统接受外源基因后不影响吱声非改造遗 传体系
又能外源基因遗传给后代，保持其遗传的稳定性 同时选材时注意尽量减小受体系统体细胞变异的发
生
具有温度的外植体来源
由于基因转化频率低，实验重复较多，因此需要稳 定的外植体来源；
常用转化外植体：种子，无菌实生苗的胚轴、子夜 或幼叶，一些植物的试管苗，以及可较高频率诱导 的营养变态器官。
农杆菌敏感性
农杆菌介导的基因转化由于具有转化效率高、多为 单拷贝插入等优点，是常用的植物基因转化方法；
第10章 植物遗传转化
8
农杆菌和基因枪转化的特点比较
1，农杆菌转化的特点： 多为单拷贝或寡拷贝转化与整合，减少了 共抑制等基因沉默现象，转基因遗传较稳 定； 不需要特殊设备，实验成本较低。
9
农杆菌和基因枪转化的特点比较
2，基因枪法转化的特点： 不受基因型限制，并且可用各种组织或细胞 作为靶材料。 操作简便。
21
第二节
转化的受体系统
二、转化受体系统的类型和特性
1，经过愈伤组织的受体系统 1.3，两种形式的共同特点：
1）外植体材料来源广泛； 2）适用的植物物种范围广； 3）再生植株群体变异大。
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第二节
转化的受体系统
二、转化受体系统的类型和特性
2，不经过愈伤组织的受体系统 也称直接分化受体系统，指直接对外植体 材料进行遗传转化操作，然后经过培养直接在 外植体上形成不定芽的情况。 这种系统的特点是 1）获得再生植株的所 需时间短，操作简单；2）遗传变异少；3）外 源基因稳定性高；4）嵌合体比例偏高；5）受 植物物种的限制比较大。
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第二节
转化的受体系统
二、转化受体系统的类型和特性 5，生殖细胞受体系统
以花粉粒或卵细胞为受体细胞进行直接的 转化的技术系统，也叫种质系统。 5.1，花粉管通道法； 5.2，花粉粒浸泡法； 5.3，花粉粒基因枪转化法； 5.4，子房微注射法。
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第二节
转化的受体系统
二、转化受体系统的类型和特性
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第二节
转化的受体系统
一、转化受体的条件
5，农杆菌敏感性 对于农杆菌介导的基因转化来说，需要受 体材料对农杆菌敏感，因为只有对农杆菌敏感 的材料才能够接受农杆菌的转化。一般认为， 大多数双子叶植物对农杆菌敏感而单子叶植物 不敏感。 农杆菌有不同的菌株，同一材料对不同菌 株的敏感程度可能存在不同；目前，还可以采 用化学试剂（乙酰丁香酮）来弥补敏感性的不 足。
第六章 目的基因的转化
2. 根癌农杆菌Ti质粒基因转化
3. 发根农杆菌Ri质粒基因转化 4. 植物病毒载体介导基因转化 5. DNA直接导入法基因转化 6. 植物种质系统介导基因转化 7. 植物质体基因转化系统
第一节 植物基因转化受体系统的建立
植物基因转化受体系统，是指用于转化 的外植体通过组织培养途径或其他非组 织培养途径，能高效、稳定地再生无性 系，并能接受外源DNA整合，对转化选择 性抗生素敏感的再生系统。
2.较高的遗传稳定性 植物受体系统接受外源DNA后不影响其自身的遗传
体系，同时又能稳定地将外源基因遗传给后代，保
持遗传的稳定性。 组织培养发现体细胞无性系变异非常普遍，而这些 变异与组织培养的方法、再生途径及外植体的基因 型等都有密切关系。 因此，在建立基因转化系统时应充分考虑到这些因素， 确保转基因植物的遗传稳定性。
20世纪70年代以来，对植物基因转化受体系统的研 究已进行了大量的工作，先后建立了多种有效的受 体系统，适应于不同转化方法的要求和不同的转化 目的。这些受体系统类型各有所长。
植物组织培养转化受体系统
植物非组织培养转化受体系统
二、植物组织培养转化受体系统
愈伤组织再生系统 直接分化再生系统 原生质体再生系统 胚状体再生系统
胚状体胚性细胞接受外源DNA能力强，是理想的基因
转化感受态细胞；
多数为单细胞起源，嵌合体少； 具有两极性，可分化出芽和根，减少生根培养环节；
利用转基因胚状体可以生产人工种子；
个体遗传背景一致、无性系变异小、胚结构完整、成 苗快、数量大等，有利于转基因植株的生产和推广； 现今普遍认为胚状体是较理想的基因转化受体系统。
胚状体再生系统 胚状体是指经体细胞胚发生而形成的形态结构和功能 上类似于有性胚的结构，又称为体细胞胚。与有性胚 一样，在一定条件下可发育成完整的植物体。 有些植物本身在自然条件下其珠心组织或助细胞就 可自发地形成胚状体。 组培过程中，一些体细胞及其单倍体细胞也诱导形 成胚状体。
植物组织培养：第十三章 植物遗传转化
• 接种时所用菌液浓度和侵染时间 是影响转基因植株再生的关键因素 之一。
• 共培养：接种菌体后的外植体培养 在诱导愈伤组织或不定芽固体培养基 上，在外植体细胞分裂、生长的同时， 农杆菌在外植体切口面也增殖生长， 两者共同培养的过程称为～。
• Horsch等(1985)首创叶盘法，用根 癌农杆菌感染烟草叶片外植体，获得 了转基因烟草。
（一）生物学特性与转 化原理
1.生物学特性
• 根癌农杆菌将Ti质粒的DNA片 段、发根农杆菌将Ri质粒的DNA 片段导入植物细胞的基因组中，导 致植物发生冠瘿瘤和毛状根。
• 根据携带不同Ti质粒的根癌农杆 菌诱导的冠瘿瘤所产生的冠瘿碱类 型，将根癌农杆菌分为章鱼碱型、 胭脂碱型和农杆碱型三种根癌农杆 菌。
一、农杆菌介导法
• Ackermann(1977)，Wullems等 (1981)，De Greve等(1982)和Spano 等(1982)首先在烟草和马铃薯中由Ri质 粒和Ti质粒转化的细胞再生出植株。
• Zambryski等(1983)和De Block等 (1984)以及Horsch等(1985)分别报道 了用切去癌基因的根癌农杆菌和发根 农杆菌进行遗传转化，获得了形态正 常的转基因植物。
第十三章 植物遗传转化
• 植物遗传转化（plant genetic transformation）：是指将外源基因 转移到植物体内并稳定地整合表达与 遗传的过程。
• 农杆菌介导法、基因枪法、植株原 位真空渗入法、电击法、聚已二醇法、 花粉管通道法、显微注射法、激光微 束法、超声波法、生殖细胞浸泡法、 脂质体法
（5） Vir区基因的活化
• 大多数双子叶植物受伤后，植物 细胞会分泌某些酚类化合物，这些 酚类化合物可诱导Vir区基因活化， 使农杆菌转化成为可能。
生菜基因转化组织培养受体系统的建立
Ｌ Ｂ培养基 ； ＭＳ培养基 ； 培养 培养 基 ： Ｓ＋乙 共 Ｍ
１ 材料与方法
１ １ 植 物 材 料 ．
酰丁香 酮 （ ０ｘ １ ４ ｔ ）＋６一Ｂ ＋Ｎ Ａ； 择 培 养基 ： ｍｏ Ａ Ａ 选
ＭＳ＋Ｋａ ｎ＋Ｃｅ／Ｃａ ｂ＋６一ＢＡ ＋ＮＡＡ。 ｆ ｒ
１ ４ 生菜再 生 系统 的建 立 ．
⑥
２ １ Ｓｉ ｅｈ Ｅ ｇｇ ０ ０ ｃ Ｔ ｃ． ｎｎ． ．
生菜基 因转化 组织培 养 受体 系统 的建立
罗 雯 孙 东妮 王 甜 王 钢
（ 安文 理 学 院 生命 科 学 系 ， 安 ７ ０ ６ ） 西 西 １０ ５
摘
要
以散 叶生菜大速 生（
脚 ｓｔ ａｖｔ ａａ ｔ Ｌ ） ａｉ ａ．ｅｐ ｔａ ． 为试材 ， ＭＳ为基本培养 基， ｖ ａ 以 采用不 同的激 素配比， 经愈伤组织
诱导、 芽分化、 生根、 移植入土四个步骤的离体培养 ， 获得 正常的再生植株 ， 建立 了散 叶生菜大速 生的基 因转化受体系统， 为下
一
步 的基 因转 化 工作 提 供 了有 利 条件 。高 效 诱 导 愈伤 组 织 培 养 基 为 ＭＳ＋ ． ｇ Ｌ６一 Ａ＋ ． ｍ ／ Ａ 高 效诱 芽 培 养 基 ０ ５ｍ ／ Ｂ ０ １ ｇ ＬＮ Ａ，
第１ Ｏ卷
第３ ４期
２１ ００年 １ ２月
科
学
技
术
与
工
程
Ｖ０ ０ Ｎ０ ３ Ｄｅｃ ２ ０ Ｌ１ ．４ Ｉ ０１
１７ — １ １ ｆ０ ０ ３ —３４ ０ ６ １ ８５ ２ １ ）４ ８８ —５
Ｓ ｉｎ ｅ Ｔ ｃ ｎ ｌ ｇ ｎ ｎ ｉ ｅ ｒ ｇ ｃ ｅ ｃ ｅ ｈ ｏｏ ｙ ａ ｄ Ｅ ｇｎ ｅ ｉ ｎ
植物基因工程
第六章 植物基因工程在自然界的许多双子叶植物中，常常发生一种严重危害植物生长的病害——冠瘿。
已知90多科，600多种双子叶植物都能感染这种病。
一般认为单子叶植物和裸子植物对此病不敏感。
70年代中期，世界上几个实验室发现诱发肿瘤的根癌农杆菌中含有大量的诱瘤质粒Ti(tumor-inducing plasmid),且证实了肿瘤的形成正是由于pTi 中的特定片段——T-DNA 转移并稳定地整合进植物细胞核基因组中的结果；由于其上载着的冠瘿碱合成基因和激素合成基因表达，因此分泌冠瘿碱并形成肿瘤。
人们就把这种冠瘿的形成过程称作天然的植物细胞转化系统。
农杆菌将自身的DNA 插入植物细胞诱发肿瘤只对其本身是有益的，重要原因之一是因课程基因工程原理与技术 班级 生物科学05 生物技术05 教师 詹亚光 范桂枝 学期第二学期 课时 6学时 上课日期 课的类型理论 授课章节 第六章 植物基因工程（1）植物基因转化受体系统的条件（2）植物基因转化受体系统的类型和特性。
（3）植物基因工程载体的种类和特性（4）根癌农杆菌Ti 质粒的结构与功能：T-DNA 、Vir 区操纵子的基因结构与功能。
（5）农杆菌Ti 质粒基因转化机理（6）农杆菌Ti 质粒的改造及载体构建（7）载体构建中常用的选择标记及报告基因（8）根癌农杆菌的转化程序及操作原理（9）外源基因在植物中的表达教学目的和要求 了解植物基因转化受体系统的类型、特性掌握Ti 质粒的结构与功能，植物载体构建原理，植物基因工程常用的载体类型。
教材分析 重点 根癌农杆菌Ti 质粒介导的基因转化的原理和方法难点 植物载体构建原理关键点 转基因植物的获取和检测主要教具和设备材料 投影仪、电脑、常规教学设备教法 板书与多媒体授课相结合思考题 1. 植物基因工程载体种类？2. 根癌农杆菌转化程序？心得为农杆菌诱发植物细胞合成冠瘿碱为自己提供食物。
植物自身不能利用这种物质，只能为它的合成付出代价，别的细菌也不能利用它，在自然条件下，只有农杆菌能分泌分解冠瘿碱的酶，将这些特异产物作为唯一的碳源和氮源来利用。
植物遗传转化的载体系统
2．植物遗传转化的载体系统。
作为植物遗传转化的载体必须是能进入宿主细胞内进行复制和表达的核酸分子。
目前的载体系统有病毒的载体系统和质位的载体系统两大类。
（1）病毒载体系统：植物病毒作为植物遗传转化的载体系统是由植物病毒的侵染特性所决定的。
以病毒作载体的表达系统为瞬时表达系统，其一般不能把外源基因整合到植物细胞基因组中。
植物病毒的感染率很高，在较短时间内可获得较大的表达量。
但因以病毒为载体的表达系统每个宿主材料都要接种病毒载体，故瞬时表达系统不易起始。
作为病毒载体的病毒最好是双链DNA植物病毒。
目前已有十几种植物病毒被改造成不同类型的外源蛋白表达载体中；包括椰菜叶病毒（CaMV）、烟草花叶病毒（TMV）、豇豆花叶病毒（CPMV）和马铃薯X病毒（PVX）等。
其中在TMV载体中成功表达的外源病毒至少有150种以上。
（2）农杆菌质粒载体系统：质粒载体系统中最常用的质粒有：Ti质粒和Ri质粒。
Ti 质粒存在于根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）中，Ri质粒存在于发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenis）中。
Ti质粒和Ri质粒在结构和功能上有许多相似之处，具有基本一致的特性。
但实际工作中，绝大部分采用Ti质粒。
农杆菌质粒是一种能实现DNA转移和整合的天然系统。
Ti质粒有两个区域：T-DNA区（是质粒上能够转移整合入植物受体基因组并能在植物细胞中表达从而导致冠瘿瘤的发生，且可通过减数分裂传递给子代的区域）和Vir区（编码能够实现T-DNA转移的蛋白）。
T-DNA长度为12-24kb之间，两端各有一个含25hp重复序列的边界序列，在整合过程中左右边界序列之间的T-DNA可以转移并整合到宿主细胞基因组中，研究发现只有边界序列对DNA的转移是必需的，而边界序列之间的T-DNA并不参与转化过程，因而可以用外源基因将其替换。
Vir区位于T-DNA以外的一个35kb内，其产物对T-DNA的转移及整合必不可少。
植物遗传转化体系的建立
8 PLANT GENETIC TRANSFORMATION
学习后的感受：
1.植物遗传转化受体？
2.植物遗传转化方法？ 3.转基因植株的再生？
4.转基因植株的检测？
8 植物遗传转化体系的建立 PLANT GENETIC TRANSFORMATION
8.1 植物基因转化的受体
所谓基因转化受体是指用于转化的外植体通过组织培养途径
8 植物遗传转化体系的建立 PLANT GENETIC TRANSFORMATION
8.2 植物基因转化的方法 8.2.1 农杆菌介导法（Agrobacterium-mediated transformation）
根 癌 农杆 菌 (Agrobacterium tumefacience) 介 导 法是植物基因转化中使用最普遍的一种方法。其Ti质 粒 (Tumor-inducing plasmid) 具有将 DNA 整合到植物 染色体上，并使之与植物内源基因同步表达的能力。
8 植物遗传转化体系的建立 PLANT GENETIC TRANSFORMATION
8 植物遗传转化体系的建立 PLANT GENETIC TRANSFORMATION
8.2 植物基因转化的方法 8.2.1 农杆菌介导法（Agrobacterium-mediated transformation） 8.2.1.2 Ti质粒的构建
8.2 植物基因转化的方法 8.2.1 农杆菌介导法（Agrobacterium-mediated transformation） 8.2.1.2 Ti质粒的构建
（ 3 ）在去除的 T-DNA 区，增加至少一个可以在植物体内表达的 选择基因，以使转化细胞易于被检测出来。 （4）在T-DNA区外加一个可以克隆外源目的基因的多聚接口。 （5）在T-DNA区外加一个抗菌素基因标记质粒，该基因只能在细 菌中表达，而不能在植物中表达。
植物基因转化的受体
12
HPT
• 潮霉素是一种很强的细胞生长抑制剂，对 许多种植物都产生很高的毒性。 • 而潮霉素磷酸转移酶基因产物通过酶促磷 酸化作用能使潮霉素失活，从而产生抗性。
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常用抗除草剂基因
• bar基因，产生PPT乙酰转移酶，抗Bialaphos或 glufosinate草铵膦 • EPSP基因，产生5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合 酶，抗glyphosate草甘磷 • GOX基因，产生草甘膦氧化酶,降解草甘膦
9
A selectable marker gene
• 抗性素类
– kanamycin resistance, nptII – hygromycin resistance, hpt
• 除草剂类
– bar gene (for resistance to herbicide phosphinothricin)草胺膦 – DHFR gene (for resistance to methotrexate)甲 氨蝶呤 – ESPS gene (for resistance to glyfosate)
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组成型表达启动子
• constitutive promoter • 也叫非特异性表达启动子 • 特点:表达没有时间、空间、组织的特异性 – 单子叶植物：来自玉米的Ubiquitin启动子和来 源于水稻的Actin1 启动子 – 双子叶植物：来自花椰菜花叶病毒 CaMV(Cauliflower mosaic virus)35S启动子
4
Let’s Build A Complex Cassette
pB19hpc (Golden Rice Cassette)
TL
aphIV
35S Gt1
psy
植物基因转化受体系统
T-DNA
RB
重组质粒直接转化农 杆菌株，该菌株携带 只 含 vir 区 不 含 T-DNA 区的Ti辅助质粒；
大肠杆菌-农杆菌穿梭质粒
农杆菌ori
大肠杆菌筛选标记
以上述重组农杆菌感 染植物细胞。
大肠杆菌ori
农杆菌筛选标记
植物病毒介导的转染程序
随着植物病毒分子生物学及遗传学研究的不断深入，用病毒基因 组作为载体转化植物细胞日益受到人们的重视，因为病毒载体能将外 源基因导入植物的所有组织和细胞中，而且不受单子叶或双子叶的限 制。
转染植物组织
双生病毒家 族成员蕃茄 金花叶病毒 （ TGMV ） 克隆表达载 体的构建程 序
TGMV A 链 TGMV dsDNA
体外复制 用目的基因和标记基因取代病毒包衣基因 克隆
农杆菌筛选标记
穿梭质粒
大肠杆菌筛选标记
转化 携带辅助质粒的农杆菌
注射 染色体上已整合了病毒B链基因的植物茎组织
重组病毒感染其他植物组织并表达目的基因
植物基因转化受体系统
植物的基本特征
植物
低等植物
无根、茎、叶等分化器官 合子不经胚直接发育为个体 藻类 地衣
高等植物
含根、茎、叶、花、果分化器官 合子经胚再发育为个体 苔藓门 蕨类门 裸子门 被子门
高等植物基因工程的基本概念
高等植物基因工程
高等植物转基因技术
植物转化受体研究进展
植物转化受体研究进展摘要为了给植物组织培养技术的建立提供理论依据，推动植物快速繁殖和品种遗传改良，介绍不同转化受体系统特点及其在生产实践中的应用。
主要讨论愈伤组织、原生质体、游离小孢子作为受体系统在植物组织培养、育种和转基因等方面的作用。
关键词愈伤组织；原生质体；小孢子；受体中图分类号 q945 文献标识码 a 文章编号 1007-5739（2013）06-0011-01植物组织培养既是植物遗传工程的基础和关键环节之一，也是一种实用性极强的高实验技术。
在植物遗传转化试验中，转化后受体的组织培养能否成功，是获得转基因植株的关键。
选择不同的受体就必须采用不同的组织培养技术，该文选取愈伤组织、原生质体、游离小孢子作为植物转化受体，对其各自特点及应用进行综述，以为其植物组织培养技术的建立提供理论依据。
1 愈伤组织受体愈伤组织的产生是由分化细胞脱分化形成的分生细胞分裂所致，其由分生细胞、薄壁细胞构成[1]，二者均可以作转化受体。
1.1 受体愈伤组织材料的选择为成功获得转基因植株，受体愈伤组织要能分化出小植株，分苗能力较强。
江丽丽等[2]利用根组织为外植体成功建立了天山雪莲植株的再生体系。
吴志萍等[3]采用花药为外植体研究愈伤组织以及不定芽的形成。
许慧敏等[4]等利用节间、叶盘和腋芽为外植体建立了啤酒花再生体系。
在愈伤组织的培养过程中，同一时间取不同的材料，或不同时间取相似的材料，培养出的愈伤组织类型有差异。
如猕猴桃，茎段产生的愈伤组织分为4种类型，其中绿色质紧的愈伤组织块分化出小植株的能力最强[5]。
1.2 共培与筛选过程中的培养共培是在共培液中同时培养工程菌、愈伤组织受体，保证工程菌在愈伤组织块细胞表面附着，从而使基因转移。
共培实现转化、获得有活性且能分化出苗的愈伤组织块与工程菌浓度、类型有关，而且与共培时间有重要关系。
如为了获得高活性与能分苗的愈伤组织块，仅进行短时间共培，则无法完成转化。
若采用长时液态共培，由于工程菌的过量附着与渗透压不平衡使组织过度损伤，共培后愈伤组织活性与分化出苗能力会显著下降[6]。
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枪击法
植物细胞的直接转化程序
将待转化的DNA沉淀在细小金属珠的表面，用特制枪将金属珠直 接打入植物细胞，枪的威力为430 m / s，植物细胞通常是胚胎细胞、 玉米籽、叶子等，但进去的DNA片段整合效率极低。
电击法
将高浓度的质粒DNA加入到植物细胞的原生质体悬浮液中，混合 物在 200 - 600 V / cm 的电场中处理若干秒钟，然后将原生质体在组 织培养基中生长 1 - 2 周，再生出整株植物。
植物工程细胞
蛋白多肽物质大规模生产 小分子化合物大规模生产
高等植物基因工程的发展历程
1983 年 美国和比利时科学家首次将外源基因导入烟草和胡萝卜 1994 年 世界上第一种耐储藏的番茄在美国批准上市 1995 年 转基因的抗虫、抗除草剂的玉米和棉花在美国投入生产 2000 年 美国转基因大豆的种植面积首次超过普通大豆 迄今为止 世界上共批准了12种作物、6大类性状的48个转基因品种 进行商业化生产，其中包括水稻、玉米、马铃薯、小麦、黑麦、红 薯、大豆、豌豆、棉花、向日葵、油菜、亚麻、甜菜、甘草、卷心 菜、番茄、生菜、胡萝卜、黄瓜、芦笋、苜蓿、草莓、木瓜、猕猴 桃、越橘、茄子、梨、苹果、葡萄等。
在大约300种特征清楚的植物病毒中，单链RNA病毒约占91%，双 链RNA病毒、双链DNA病毒、单链DNA病毒各占3%。利用植物病毒 载体转化植物细胞大致有以下两种战略：
植物病毒介导的转染程序
转染植物细胞原生质体
以双链DNA病毒花椰菜花斑病毒（CaMV）基因组作为载体，去 除有关的致病性基因，换上外源基因，体外包装成有感染力的病毒颗 粒，转染植物细胞原生质体，并由此再生成整株植物。
T-DNA
RB
重组质粒直接转化农 杆菌株，该菌株携带 只 含 vir 区 不 含 T-DNA 区的Ti辅助质粒；
大肠杆菌-农杆菌穿梭质粒
农杆菌ori
大肠杆菌筛选标记
以上述重组农杆菌感 染植物细胞。
大肠杆菌ori
农杆菌筛选标记
植物病毒介导的转染程序
随着植物病毒分子生物学及遗传学研究的不断深入，用病毒基因 组作为载体转化植物细胞日益受到人们的重视，因为病毒载体能将外 源基因导入植物的所有组织和细胞中，而且不受单子叶或双子叶的限 制。
共整合转化程 序
多克隆位点
大肠杆菌质粒 农杆菌筛选标记
大肠杆菌筛选标记
重组质粒 转化
农杆菌
细菌接合
T-DNA区同源整合
农杆菌
大肠杆菌
感染植物根部细胞
T-DNA区整合在植物细胞基因组上
二元整合转化程序
将外源基因克隆在大肠 杆菌-农杆菌穿梭质粒 的T-DNA区内；
外源基因
LB
植物细胞筛选标记 Kmr
植物基因转化受体系统
植物的基本特征
植物
低等植物
无根、茎、叶等分化器官 合子不经胚直接发育为个体 藻类 地衣
高等植物
含根、茎、叶、花、果分化器官 合子经胚再发育为个体 苔藓门 蕨类门 裸子门 被子门
高等植物基因工程的基本概念
高等植物基因工程
高等植物转基因技术
高等植物细胞基因表达技术
转基因植株 农作物遗传性状改良
转染植物组织
双生病毒家 族成员蕃茄 金花叶病毒 （ TGMV ） 克隆表达载 体的构建程 序
TGMV A 链 TGMV dsDNA
体外复制 用目的基因和标记基因取代病毒包衣基因 克隆
农杆菌筛选标记
穿梭质粒
大肠杆菌筛选标记
转化 携带辅助质粒的农杆菌
注射 染色体上已整合了病毒B链基因的植物茎组织
重组病毒感染其他植物组织并表达目的基因
LB
RB
T-DNA
Vir 区 区
Ti plasmid
Opine 代代谢谢区 区
复复制制起起始区始 区
Ti 质粒的结构与功能
Ti 质粒致瘤的分子机制 损伤的植物根部会分泌出乙酰 丁香酸和羟基乙酰丁香酸，它 们能诱导Ti质粒上的vir基因以 及根瘤菌染色体上的一个操纵 子表达。vir基因产物将Ti质粒 上的T-DNA单链切下，而根瘤 菌染色体上的操纵子表达产物 则与单链T-DNA结合形成复合 物，后者转化植物根部细胞。
植物病毒介导的转染程序
转染植物组织
植物双生病毒（Geminiviruses）为一单链DNA病毒，成熟的双 生病毒呈双颗粒状，每一个颗粒中含有一条不同的DNA单链。其中A 链能单独在植物细胞中复制，并含有一部分病毒包衣蛋白基因；B链 编码另一部分包衣蛋白基因及感染性基因。A、B两条链必须同处于 一个植物细胞中，方能形成有感染力的病毒。双生病毒具有广泛的宿 主细胞范围，因此是一种很有潜力的植物病毒载体。
Ti 质粒的结构与功能
Ti 质粒的图谱 整个质粒 160 - 240 kb 其中 T-DNA 12 - 24 kb tms 的编码产物负责：
合成吲哚乙酸 tmr 的编码产物负责：
合成植物分裂素 tmt 的编码产物负责：
合成氨基酸衍生物 冠瘿碱
( tms ) ( tmr ) ( tmt ) iaa H iaa M ipt Z Auxin Cytokinin Opine
高等植物的基因转移系统
Ti 质粒介导的整合转化程序 植物病毒介导的转染程序 植物细胞的直接转化程序
Ti 质粒介导的整合转化程序
Ti 质粒的结构与功能
几乎所有的双子叶植物尤其是豆科类植物的根部常常会形成 根瘤，这是由于植物根部被一种革兰氏阴性土壤杆菌农杆根瘤菌 （A.tumefaciens）感染所致，其致瘤特性是由该菌细胞内的野生 型质粒 Ti（Tumor-inducing）介导的。
乙酰丁香酸 根瘤菌细胞
植物根部 羟基乙酰丁香酸 Ti 质粒 单链 T-DNA
植物细胞
Ti 质粒的结构与功能 T-DNA的染色体整合机制
基之间切开 单链T-DNA整合在植物的基因组上
Ti 质粒的结构与功能 T-DNA的染色体整合机制
Ti 质粒的改造
除去T-DNA上的生长素（tms）和分裂素（tmr）生物合成基因，因 为大量的生长素和分裂素会抑止细胞再生长为整株植物；
除去T-DNA上的有机碱生物合成基因（tmt）；因为有机碱的合成 大量消耗精氨酸和谷氨酸，影响植物细胞的生长；
除去 Ti 质粒上的其它非必需序列，最大限度地缩短载体的长度； 安装大肠杆菌复制子，使其能在大肠杆菌中复制，以利于克隆操作 ；安装植物细胞的筛选标记，如 neor 基因，使用植物基因的启动子 和polyA化信号序列； 安装多聚人工接头以利于外源基因的克隆。