杀菌剂生物测定

管碟法
E26细菌素粗提物抑菌活性测定 E26细菌素粗提物抑菌活性测定
2.滤纸片法
操作步骤是：与管碟法不同处在于将药液定 操作步骤是：与管碟法不同处在于将药液定 量地滴加在小滤纸片上(直径1 量地滴加在小滤纸片上(直径1一8mm) 。晾 干，放于带菌的培养基上,,测定抑菌圈直径。 干，放于带菌的培养基上,,测定抑菌圈直径。 特 点：精确度较高,用药量少,操作较简便, 点：精确度较高,用药量少,操作较简便, 应用面广
二、毒力测定方法（离体实验）
菌体生长率测定方法及步骤（续） 菌体生长率测定方法及步骤（续）
②打菌饼：用直径0.4-0.5厘米打孔器在培养好 打菌饼：用直径0.4-0.5厘米打孔器在培养好 的菌落外缘切下菌饼。 ③移植菌饼：用消毒接种针或镊子将切好的菌饼 反转移植到含药的培基上, 反转移植到含药的培基上,置于菌的适宜生长条 件下培养 ④测量 测量菌饼扩展的直径,与不混药对照菌盘 测量菌饼扩展的直径, 扩展的直径相比, 扩展的直径相比,求出药剂的抑制生长率。结果 表示方法有：一是一定时间内菌落直径的大小； 二是菌落达到一定直径所需时间。常用前者表示。
• 优点：易于控制、操作简便迅速、精确度
较高。 • 缺点：测定结果与生产实际距离较大，而 有些化合物必须在寄主植物体内活化后才 起杀菌作用
二、毒力测定方法（离体实验）
•孢子萌发法(spore germination methods) 孢子萌发法(spore
通过药剂与病菌孢子接触后, 通过药剂与病菌孢子接触后,根所抑制病菌 孢子萌发率来判定药剂效力。此法可用於筛 选杀菌剂、药剂毒力及作用方式的测定。
生 长 速 率 测 定 法
生 长 7
生 长 3
HX HX HX HX 2
二、毒力测定方法
•扩散法（垂直、水平） 扩散法（垂直、水平）
基本原理 是在已接种的琼脂培养基上, 是在已接种的琼脂培养基上, 已接种的琼脂培养基上 施加少量抗菌物质, 抗菌物质 施加少量抗菌物质,使其接触培养基和 病菌, 培养后, 病菌, 培养后, 由于抗菌物的扩散而产 生抑菌圈( ),其大小与剂量呈比例 其大小与剂量呈比例。 生抑菌圈(带),其大小与剂量呈比例。 水平扩散法 在培养基平面,接菌, 在培养基平面,接菌, 培养，测量抑 菌圈，故又称抑制菌圈法等
二、毒力测定方法（离体实验）
•主要测定方法： 主要测定方法： •孢子萌发法 •抑菌圈法（管碟法、滤纸片法、孔碟 法和琼脂柱法） •生长速率法 •琼脂扩散法等。
二、毒力测定方法（离体实验）
•基本要求： 基本要求：
•①菌种在分类、数量上要有代表性, 敏感（野生）、 菌种在分类、数量上要有代表性, 敏感（野生） 易培养; 易培养; •②严格控制试验条件； •③选择一致且标准化纯种; 选择一致且标准化纯种; •④各处理要设重复和对照（空白、与药剂用的溶剂 各处理要设重复和对照（空白、 等和标准药剂对照; 等和标准药剂对照; •⑤用生物统计方法
•孢子萌发方法及步骤（续）
③准备菌种:应有大量孢子，标准菌种，菌种纯， 准备菌种: 不易发生变异，孢子体形大、萌发快, 不易发生变异，孢子体形大、萌发快,易在显微 镜下观察，在分类上有一定代表性, 镜下观察，在分类上有一定代表性,如马铃薯晚 疫病菌、水稻稻瘟病菌等 ④孢子萌发:要求孢子萌发整齐和稳定.利用孢子 孢子萌发:要求孢子萌发整齐和稳定. 萌发的主要因素是温度、湿度、光照和空气等。 为使孢子萌发整齐, 为使孢子萌发整齐,常在孢子液中加些植物汁液 或糖、盐类的营养液等, 或糖、盐类的营养液等,促进孢子萌发。但要因 菌而异。 ⑤ 结果调
主要方法： 主要方法： 1.管碟法：药液滴加洋菜培养基表面的 管碟法： 小圆筒内（不锈钢）， ），8 10mm； 小圆筒内（不锈钢），8×６ × 10mm； 2.滤纸片法：药剂加在圆形小滤纸片上, 2.滤纸片法：药剂加在圆形小滤纸片上, 滤纸片法 平放于培养基平面，直径为6 8mm； 平放于培养基平面，直径为6-8mm；
二、毒力测定方法（离体实验）
菌体生长速率测定方法及步骤（续） 菌体生长速率测定方法及步骤（续）
实际抑制生长率应为: 实际抑制生长率应为:
实际抑制生长率应= 实际抑制生长率应=【（对照菌落直径-处理菌落直径）/（对 对照菌落直径-处理菌落直径） 照菌落直径-菌饼直径） 照菌落直径-菌饼直径）】×100%
•孢子萌发法（续） 2、方法及步骤：
二、毒力测定方法（离体实验）
①玻璃器皿消毒 必须清洁、无污染， 为液滴扩散一致, 为液滴扩散一致,常涂上火棉胶（用镊 子夹取清洁干燥的玻片浸入0.25%火棉 子夹取清洁干燥的玻片浸入0.25%火棉 胶乙醚溶液后立即取出，待多余的流 去，无尘条件下室温干燥10h以上 去，无尘条件下室温干燥10h以上 ）
二、毒力测定方法（离体实验）
•孢子萌发法（续）
通过药剂与病菌孢子接触后, 通过药剂与病菌孢子接触后,根所抑制病菌孢 子萌发率来判定药剂效力。此法可用於筛选杀 菌剂、药剂毒力及作用方式的测定。 1、 原 理：将供试药剂用各种方法附着于载 玻片或其他平面上, 玻片或其他平面上,再将病菌孢子悬浮液滴在上 面(或将药剂与病菌孢子液混合后滴于载玻片 上),定温定湿下培养一定时间,镜检于孢子萌发 ),定温定湿下培养一定时间, 率,以抑制孢子萌发百分率多少来判定药剂毒力 大小。
第二节杀菌剂毒力测定
Evaluation of Fungicide Toxicity
Bioassay of Pesticides
1
第二节 杀菌剂毒力测定
•绪论
•毒力测定的方法 •室内药效测定方法
第二节杀菌剂毒力测定
• 杀菌剂生物测定(bioassay of fungicide) 杀菌剂生物测定(bioassay
②载玻片附药:方法有三种. 载玻片附药:方法有三种. 一是供试药液与病菌孢子悬浮液混合后滴于 载玻片上（简、快、适），对水溶性药剂 和稳定悬浮液适用，对非水溶性药剂或沉 降较快的可参考。 二是将供试药剂滴加于载玻片表面, 二是将供试药剂滴加于载玻片表面,干燥后形 成一定面积的药膜, 成一定面积的药膜,再将孢子悬浮液滴于药 膜上（对非水溶性药剂可用有机溶剂溶解 后摘加，但易溶火棉胶； 三是利用精密喷雾装置将药剂喷布于载玻片 上,干燥滴加孢子悬液
3、注意的问题
（1）一般的毒力测定对菌种要求不严, 有 一般的毒力测定对菌种要求不严, 抑菌圈均可。但定量测定时, 抑菌圈均可。但定量测定时,菌株
滤纸片法
3、注意的问题
要敏感，抑菌圈界限明显，易培养, 要敏感，抑菌圈界限明显，易培养,生长 快,不易污染菌种，有较强的抗热性。 不易污染菌种，有较强的抗热性。 （ 2 ） 固体培养基均可 , 但其组分、 pH 值 固体培养基均可, 但其组分 、 pH值 与抑菌圈的大小、 与抑菌圈的大小、边缘有关 （3）药量一致，药剂应呈溶解状态，不 药量一致，药剂应呈溶解状态， 溶于水的药剂应用酒精、 溶于水的药剂应用酒精 、 丙酮或其它适 当溶剂溶解,然后加水稀释成所需浓度。 当溶剂溶解,然后加水稀释成所需浓度。
菌体生长速率测定法 菌体生长速率测定法
是利用病菌在含有不同浓度药剂的培养基上 生长速度的快慢, 生长速度的快慢,来判定药剂毒力大小的测定 方法。适用于不产孢子或缓慢, 方法。适用于不产孢子或缓慢,而菌丝生长迅 速、整齐、平伏于培养基上呈放射状生长的病 菌。
1、测定方法及步骤
①带毒培养基制备 将供试药液稀释成系列 浓度, 浓度,将一定量的药液加入到融化的培羔墓 中,混合均匀倒入培养皿内,冷却成带毒培 混合均匀倒入培养皿内, 养基。要注意药液后浓度变化，一般以 1ml：9ml为宜, 1ml：9ml为宜, 不影响凝固，而药剂被稀 释10倍。若药挥发性强、易热解, 培养基 10倍。若药挥发性强、易热解, 冷却到45℃ 冷却到45℃再加入药剂。
•其它测定方法
1、附着法
是将病菌孢子附着于灭菌的种子、 是将病菌孢子附着于灭菌的种子、滤纸 片、果皮或其他保护材料上,使其接触药剂, 果皮或其他保护材料上,使其接触药剂, 培养，以有无菌丝生长比较药剂。主要有2 培养，以有无菌丝生长比较药剂。主要有2 种：
•
滤纸片附着法 一般是将直径6毫米的小滤 一般是将直径6 纸片进行干热灭菌后,在其上滴加1 纸片进行干热灭菌后,在其上滴加1-2滴孢子 悬浮液,再将其在药液中浸泡数分钟, 悬浮液,再将其在药液中浸泡数分钟,用镊子 夹取并振落多余药液, 放于培养基上, 夹取并振落多余药液, 放于培养基上, 培养 2-3 日观察有无菌丝生长；也可将 1 毫升药 日观察有无菌丝生长；也可将1 液与10毫升培养基混合, 液与10毫升培养基混合,凝固后放上含菌的 滤纸片, 培养2 滤纸片, 培养2-3日,观察,比较毒力大小 观察,
1.管碟法（抗菌素，如青霉素通用） 管碟法（抗菌素，如青霉素通用）
操作步骤是：取培养皿,倒入约20ml水洋菜 操作步骤是：取培养皿,倒入约20ml水洋菜 培养基,凝固。后溶化PDA,在50-60℃时 培养基,凝固。后溶化PDA,在50-60℃时,接 种供试菌〈细菌、真菌孢子〉 取其少量, 种供试菌〈细菌、真菌孢子〉,取其少量, 均匀倒入, 成菌层。在菌层上放数个（4 均匀倒入, 成菌层。在菌层上放数个（4个） 钢筒，标准药液和不同浓度药液, 培养, 钢筒，标准药液和不同浓度药液, 培养, 十字交叉抑菌圈的直径, 十字交叉抑菌圈的直径,取其平均值。 特点 是精确度高，适用广，可靠性强。但 要制作底层和菌层,操作麻烦, 要制作底层和菌层,操作麻烦,可改进。
利用病原菌或感菌生物体对杀菌剂的反应, 利用病原菌或感菌生物体对杀菌剂的反应, 来确定杀菌剂效力的农药生物测定. 来确定杀菌剂效力的农药生物测定. 简史 • 1907年福尔克(D.Falck)在研究木材防腐发 1907年福尔克 年福尔克(D.Falck)在研究木材防腐发 现,真菌在固体培养基上生长速率与时间成直 线关系。 线关系。这个发现后来成为测定杀菌剂毒力的 标准方法之一。 标准方法之一。 • 1930年麦卡兰(S.EA.McCallan)发表关于杀 1930年麦卡兰 年麦卡兰(S.EA.McCallan)发表关于杀 菌剂室内测定方法的论文, 菌剂室内测定方法的论文,为近代杀菌剂的测 定方法开了道路。 定方法开了道路。