PCR技术(包含引物设计)

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聚合酶链式反应(PCR)

原理:

DNA的半保留复制时,双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链,在DNA聚合酶与启动子的参与下,根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。在实验条件下,DNA在高温时也可以发生变性解链,当温度降低后又可以复性成为双链。因此,通过温度变化控制DNA的变性和复性,并设计引物做启动子,加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。PCR类似于DNA的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。

PCR由变性 - 退火(复性)- 延伸三个基本反应步骤构成:

①模板DNA的变性:模板DNA经加热至94℃左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备;

②模板DNA与引物的退火(复性):模板DNA经加热变性成单链后,温度降至40~60℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合;

③引物的延伸:DNA模板 - 引物结合物在DNA聚合酶的作用下,于72℃左右,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链,重复循环就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2~4分钟,2~3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。PCR技术分类(常用)

(1)反向PCR技术(Inverse PCR, IPCR):反向PCR是克隆已知序列旁侧序列的一种方法.主要原理是用一种在已知序列中无切点的限制性内切酶消化基因组DNA.后酶切片段自身环化.以环化的DNA作为模板,用一对与已知序列两端特异性结合的引物,扩增夹在中间的未知序列。该扩增产物是线性的DNA片段,大小取决于上述限制性内切酶在已知基闲侧翼DNA 序列内部的酶切位点分布情况。用不同的限制性内切酶消化,

可以得到大小不同的模板DNA,再通过反向PCR获得未知片段。

(2)锚定PCR技术(Anchored PCR, APCR):用酶法在一通用引物反转录cDNA3’-末端加上一段已知序列, 然后以此序列为引物结合位点对该cDNA进行扩增, 称为APCR。

(3)不对称PCR技术(asymmetric PCR):两种引物浓度比例

相差较大的PCR技术称不对称PCR。在扩增循环中引入不同的引物浓度, 常用50~100÷1比例。在最初的10~15个循环中主要产物还是双链DNA, 但当低浓度引物被消耗尽后, 高浓度引物介导的PCR反应就会产生大量单链DNA。

(4)反转录PCR技术(reverse transcription PCR, RT-PCR):当扩增模板为RNA时, 需先通过反转录酶将其反转录为cDNA才能进行扩增。应用非常广泛, 无论是分子生物学还是临床检验等都经常采用。

(5)巢式PCR技术(NEST-PCR):先用一对靶序列的外引物扩增以提高模板量, 然后再用一对内引物扩增以得到特异的PCR 带, 此为巢式PCR。若用一条外引物作内引物则称之为半巢式PCR。为减少巢式PCR的操作步骤可将外引物设计得比内引物长些, 且用量较少, 同时在第一次PCR时采用较高的退火温度而第二次采用较低的退火温度, 这样在第一次PCR时, 由于较高退火温度下内引物不能与模板结合, 故只有外引物扩增产物, 经过若干次循环, 待外引物基本消耗尽, 无需取出第一次PCR产物, 只需降低退火即可直接进行PCR扩增。这不仅减少操作步骤, 同时也降低了交叉污染的机会。这种PCR称中途进退式PCR,主要用于极少量DNA模板的扩增。

(6)多重PCR技术(multiplex PCR):在同一反应中用多组引物同时扩增几种基因片段,如果基因的某一区段有缺失,则相应的电泳谱上这一区带就会消失。主要用于同一病原体的分型及同时检测多种病原体、多个点突变的分子病的诊断。

(7)重组PCR技术:重组PCR技术是在两个PCR扩增体系中, 两对引物分别由其中之一在其5’-端和3’-端引物上带上一段互补的序列,混合两种PCR扩增产物,经变性和复性,两组PCR产

物互补序列发生粘连,其中一条重组杂合链能在PCR 条件下发生聚合延伸反应,产生一个包含两个不同基因的杂合基因。

(8)原位PCR技术:利用完整的细胞作为一个微小的反应体系来扩增细胞内的目的片段,在不破坏细胞的前提下,利用一些特定的检测手段来检测细胞内的扩增产物。直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞中进行PCR扩增,可进行细胞内定位,适用于检测病理切片中含量较少的靶序列。

(9)荧光定量实时PCR技术

反应动力学

PCR的三个反应步骤反复进行,使DNA扩增量呈指数上升,最终DNA扩增量可用Y=(1+X)n计算,Y代表DNA片段扩增后的拷贝数,X表示平均每次的扩增效率,n表示循环次数。平均扩增效率理论值为100%,但实际情况达不到,反应初期靶序列DNA片段的增加呈指数形式,随着PCR产物的逐渐积累,被扩增的DNA片段不再呈指数增加,而进入线性增长期或静止期,即出现“停滞效应”,此效应称平台期,与DNA聚合酶数量和活性、PCR扩增效率、非特异性产物的竞争等因素有关。

PCR扩增产物

可分为长产物片段和短产物片段两部分,短产物片段的长度严格地限定在两个引物链5’端之间,是需要扩增的特定片段。短、长产物片段是由于引物所结合的模板不同而形成的,以一个原始模板为例,在第一个反应周期中,以两条互补的DNA为模板,引物是从3’端开始延伸,其5’端是固定的,3’端则没有固定的止点,长短不一,这就是长产物片段。进入第二个反应周期后,引物除与原始模板结合外,还要同新合成的链(长产物片段)结合引物在与新链结合时,由于新链模板的5’端序列是固定的,故这次延伸的片段3’端被固定了止点,保证了新片段的起点、止点都限定于引物扩增的序列以内,形成长短一致的短产物片段。由于短产物片段是按指数倍数增加,而长产物片段则以算术倍数增加,故可忽略不计,使得PCR的反应产物不需再纯化既可以保证足够纯的DNA片段供分析、监测。

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