土壤微生物的分离及鉴定

微生物实验报告——土壤微生物的分离筛选纯化与鉴定

山东大学生命科学学院2011级生物基地

（周一下午*组）

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同组者：

指导老师：

时间：2012年12月9日——2012年12月21日

摘要

利用分离纯化微生物的基本操作技术对土壤中的微生物进行分离与纯化，通过对菌落形态的观察、染色鉴定以及一系列的生理生化试验的结果，通过查阅《伯杰氏系统细菌学手册》对照种属特征最终判断所分离纯化的细菌所属的属。

关键词

土壤微生物，分离鉴定，生理生化，酶活测定，《伯杰氏系统细菌学手册》

前言

土壤是微生物的良好生境，土壤中有多种类群的微生物，它们对自然界物质的转化和循环起着极为重要的作用，对农业生产和环境保护有着不可忽视的影响。土壤中微生物的数量因土壤类型、季节、土层深度与层次等不同而异。一般地说，在土壤表面，由于日光照射及干燥等因素的影响，微生物不易生存，离地表10 cm～30 cm的土层中菌数最多，随土层加深，菌数减少。

通过土壤微生物的分离纯化，得到纯种，再进行相关的实验，如：菌落观察、革兰氏染色、芽孢染色、生理生化试验等，根据实验结果，查阅《伯杰氏系统细菌学手册》确定所分离纯化细菌所属的属。在此过程中熟悉相关操作。

一．实验目的

1.学会设计实验方案；

2.分离目的菌，掌握几种常用的分离纯化微生物的基本操作技术；

3.复习巩固显微镜使用方法；

4.复习配制培养基的一般方法和步骤、复习各种灭菌方法和操作步骤；

5.复习、掌握细菌稀释分离、划线分离等技术。复习并掌握平板倾注法和斜面接种技术，了解培养细菌的培养条件和培养时间。复习平板菌落计数法；

6.复习掌握细菌的简单染色、鞭毛染色、革兰氏染色的基本原理和操作方法，复习霉菌的小室培养法；

7.复习生理生化试验的原理及操作方法，学习测定酶活的实验方法；

8.学会利用《伯杰氏系统细菌学手册》对所分离纯化的细菌定属。二．实验原理

1.产果胶酶菌株的筛选

配制以果胶为唯一碳源的筛选培养基，在该培养基上，只有能分解利用果胶的菌株才能够生长，依此来从土壤中筛选出能够产果胶酶的菌株。

刚果红（Congo Red,简称CR）是一种染料，它可与果胶形成红色复合物，但并不和果胶水解后的产物发生这种显色反应，在含有果胶的培养基中加入刚果红时，刚果红能与培养基中的果胶形成红色复合物。当果胶被果胶分解菌分泌的果胶酶分解后，刚果红-果胶的复合物就将无法形成，从而在培养基中形成以果胶分解菌为中心的透明圈，这样我们就可以通过是否产生透明圈来筛选果胶分解菌。

2.产几丁质菌株的筛选

配制以几丁质为唯一碳源的筛选培养基，在该培养基上，只有能分解利用几丁质的菌株才能够生长，依此来从土壤中筛选出能够产几丁质酶的菌株。因为几丁质不能溶解于培养基，故在固体培养基平板上表现为浑浊，若菌株能够产生几丁质酶，则在培养基中形成以菌落为中心的透明圈，因此可以通过是否产生透明圈来筛选几丁质酶产生菌株。

为筛选到真菌，采用加入链霉素来抑制细菌生长。

3.菌落形态描述

通过培养的方法使肉眼看不见的单个菌体在固体培养基上，经过生长繁殖形成几百万个聚集在一起的肉眼可见的菌落。平板培养基含有细菌生长所需要的营养成分，当取自不同来源的样品接种于培养基上，在37℃温度下培养，1—2天内每一菌体即能通过很多次细胞分裂而进行繁殖，形成一个可见的细胞群体的集落，称为菌落。每一种细菌所形成的菌落都有它自己的特点。因此，可通过平板培养来检查环境中细菌的数量和类型。

4.单染色观察个体形态

单染色即用单纯的种染料进行染色，多数采用美蓝、结晶紫或石碳酸复红等碱性染料。此法仅能显示细胞的外部形态，而不能辨别其内部结构。染色前必须将细胞固定，其目的是杀死细菌，并使它粘附在载玻片上。此外，还可以增加菌体对染料的亲和力。常用的有加热

和化学固定两种方法。无论用哪种方法都应尽量使细菌维持原有的形态，防止细胞膨胀或收缩。

5.革兰氏染色法

革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。革兰氏染色法不仅能观察到细菌的形态，而且还可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示：染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏阴性细菌，用G-表示。细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。

革兰氏染色需用四种不同的溶液：碱性染料初染液；媒染剂；脱色剂和复染液。碱性染料初染的作用像在细菌的单染色法基本原理中所述的那样，而用于革兰氏染色的初染液一般是结晶紫。媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和性或附着力，即以某种方式帮助染料固定在细胞上，使不易脱落，碘是常用的媒染剂。脱色剂是将被染色的细胞进行脱色，不同类型的细胞脱色反应不同，有的能被脱色，有的则不能，脱色剂常用95 ％的酒精。复染液也是一种碱性染料，其颜色不同于初染液，复染的目的是使被脱色的细胞染上不同于初染液的颜色，而未被脱色的细胞仍然保持初染的颜色，从而将细胞区分成G+和G-两大类群，常用的复染液是番红。

6.芽孢染色

芽孢是芽孢杆菌属和梭菌属细菌生长到一定阶段形成的一种抗逆性很强的休眠体结构，也被称为内生孢子（endospore），通常呈圆

形或椭圆形。细菌能否形成芽孢及芽孢的形状，着生部位、芽孢囊是否膨大等特征都是细菌分类的重要指标。与正常细孢或菌体相比，芽孢壁厚、透性低而不易着色，但是，芽孢一旦着色就很难被脱色。利用这一特点，首先用着色能力较强的染料（如孔雀绿或石碳酸复红）在加热条件下进行染色，此染料不仅可以进入菌体，而且也可以进入芽孢，进入菌体的染料可经水洗脱色，而进入芽孢的染料则仍然保留。再用对比度大的复染剂（如番红液）染色后，菌体染上复染剂颜色，而芽孢仍为原来的颜色，这样就可以将两者区别开来。

7. 细菌运动性检测——半固体穿刺法

将细菌穿刺培养于半固体培养基中，经培养后，无鞭毛的细菌沿穿刺线生长，穿刺线清晰；有鞭毛的细菌沿穿刺线向四周扩散，穿刺线模糊不清。

8.鞭毛染色

鞭毛是细菌的运动“器官”，一般细菌的鞭毛都非常纤细。鞭毛的有无、数量及着生方式也是细菌分类的重要指标。根据鞭毛的特征，可将有动力细菌分为单端极鞭毛菌、单端丛鞭毛菌、周鞭毛菌、侧鞭毛菌。鞭毛直径一般为10~30nm，只有用电镜才能直接观察到。在普通光学显微镜的分辨力限度以外，故需要用特殊的鞭毛染色法，才能看到。首先用媒染剂（如单宁酸或明矾钾）处理，使媒染剂附着在鞭毛上使其加粗，然后用碱性复红（Gray氏染色法）、碱性复品红（Leifson氏染色法）、硝酸银（West氏染色法）或结晶紫（Difco

氏染色法）进行染色。