微流控分析芯片用于凝血检测的实验研究

河北工业大学
硕士学位论文
微流控分析芯片用于凝血检测的实验研究
姓名：孟庆宜
申请学位级别：硕士
专业：测试计量技术及仪器
指导教师：张思祥
20071201
河北工业大学硕士学位论文
微流控分析芯片用于凝血检测的实验研究
摘要
随着科学技术的发展和基础医学研究的进步，人们对止血与血栓的发生发展认识越来越深刻，其检测手段也越来越先进。

与此同时，分析仪器也日益向着微型化、集成化与便携化的趋势发展。

其中，微分析系统是这一发展时期的典型代表，随着微流控芯片技术的发展，特别是检测灵敏度的日臻提高，用微流控芯片对微量物质的分析与检测日益受到重视。

本课题研究的目的就是采用微流控芯片作为检测容器，在凝血检测中最大限度地把加试剂、反应、检测等分析功能集成为一体。

本课题在分析、总结了传统的检测原理及方法的基础上，设计了利用微流控芯片进行凝血四项检测的基本方法。

首先我们利用步进电机设计了离心力驱动微流控芯片结构，该结构可在芯片旋转过程中完成血浆与试剂的混合、反应等操作。

同时，运用能发射红光和蓝光的双光束二极管为恒定光源，光束透过芯片的检测区，在其另一面有硅光电池接收光信号。

在与凝结剂均匀混合后，血浆由于发生一定的理化反应而凝结，光信号也会随之发生改变。

硅光电池将光信号的变化转换成电信号的变化，经采集可显示整个凝结过程图像，经数据处理后计算，可得到需要的信息。

本课题根据检测原理重点对检测装置的机械部分进行了设计和改善，选择了微流控芯片来替代传统的玻璃试管作为检测容器，以改进用玻璃试管检测时所存在的问题，提高精度和可靠性；同时，对检测系统的硬件电路部分和基于LabVIEW 的检测系统操作软件进行了设计和完善，以提高系统的准确性，可靠性和稳定性；并且在研究和改进过程中完成了大量有效的实验。

采用微流控芯片作为检测容器与传统玻璃试管相比，试剂混合均匀，能去除透镜效应，且实验一致性好。

该检测系统的研究成功将进一步促进我国医学检测技术的发展，同时，将加快微流控芯片的产业化，为分析仪器提供新的经济增长点。

关键词: 微流控芯片，凝血检测，虚拟仪器，离心力驱动
i
微流控分析芯片用于凝血检测的实验研究
ii
RESAERCH OF CRUOR MEASURING SYSTEM
USING MICROFLUIDIC CHIP
ABSTRACT
With the development of science and the progress of medical research, people’s
understanding through thrombus and hemostasis is more and more profound, the request of examine method is also more and more advanced. At the same time, analytic instrument has had the current characteristics of micromation, integration and conveniency day after day. μTAS is the representation in this period. With the development of microfluidic technology, especially the advancement in detection, it is more and more important to analyse and detect micro-substance using microfluidic chips. Our research is to use microfluidic chip as detecting container, and the function of injecting the reagent, reacting and detecting are to be done all together.
On the basis of analyzing and summarizing the traditional examination principle and method, our work studies the basic method of cruor testing using microfluidic chip. Firstly, we design a frame called centrifugal force running microfluidic chip, which can finish the mixture and reaction of the plasm and reagent during the chip’s circumrotation. Then we take the red light or blue light as the constant photosource. The light beam goes through the detecting area, and on the other side of the chip there is a silicon photronic generator which will receive the luminous intensity signals. Because of the chemical reaction, the plasma congeals, so the luminous intensity changes. The silicon photoelectric generator transforms the luminous intensity signals to the electrical signals. After acquiring the electrical signal, the entire process of congeals may be demonstrated. And after the data processing and calculation, the requested information is acquired.
Our work mainly designed and improved the machine part of the system. We chose microfluidic chip to substitute the traditional cuvette as testing container, so as to correct the objection of cuvette, as well as improve the precision and reliability of the system. Meanwhile, we improved the hardware of the system and designed the software based on the LabVIEW platform servers, to improve the accuracy, reliability and stability of the system. During the designing and improving process, we have also done many effective experiments.
Compared with the traditional cuvette system, using microfluidic chip as testing container can wipe off lens effect, the plasm and the reagent mixed uniformly, and the experiments have good consistency. The success of this system will promote the medicine examination technology of our country. It can also quicken the microfluidic chip industrialization and provide analytic instrument new economic increase.
KEY WORDS: microfluidic chip, cruor testing, LabVIEW, centrifugal force running
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符号说明
PT －Prothrombin Time，凝血酶原时间。

APTT －Activated Partial Thromboplastin Time，凝血活酶时间。

FIB －Fibrinogen，纤维蛋白原。

TT －Thrombin Time，凝血酶时间。

PRP －Platelet-rich Plasma，富含血小板血浆。

PPP －Platelet-poor Plasma，贫含血小板血浆。

DIC —Dessiminated Intiavascular Coagulation，弥散性血管内凝血。

I/O －Input/Output，输入/输出。

A/D －Analog/Digital，模拟/数字。

μl —微升。

R －电路中电阻的通用符号。

C －电路中电容的通用符号。

f －频率，赫兹。

ρ－相关系数。

δ－重复性误差。

v
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除文中已经注明引用的内容外，本学位论文的研究成果不包含任何他人创作的、已公开发表或者没有公开发表的作品的内容。

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第一章绪论
§1-1 课题提出的背景
随着科学技术的飞速发展和进步，人类在生命科学和生物技术领域的探索也掀开了新的篇章，相应地，检验医学的研究和深入面临着更高的要求和更大的挑战。

面对21世纪科技发展中提出的众多挑战，分析仪器和分析科学也正经历着深刻的变革，其中一个日益明显的发展趋势就是仪器设备的微型化、集成化与便携化。

当前，分析仪器的发展正在出现一个以微型化为主要特征的、带有革命性的重要转折时期。

其中，微分析系统是这一发展时期的典型代表，随着微流控芯片技术的发展，特别是检测灵敏度的日臻提高，用微流控芯片对微量物质的分析与检测日益受到重视。

与此同时，近十几年来，随着血栓性疾病与出血性疾病在人类疾病谱中地位的变化及防治研究的迅速进展，血栓与止血的实验诊断技术也不断有新的发展并在全国逐步普及。

血栓性疾病，尤其是心、脑血管血栓性疾病，已成为我国人口病死原因的第一位，而且发病率有所增加，严重危害人类健康[1]。

血栓与止血相关的检验，是近年来临床血液学发展最快的领域。

随着科学技术的发展和基础医学研究的进步，人们对止血与血栓的发生发展认识越来越深刻，其检测手段也越来越先进，其中一个显著的特点是凝血仪的迅速发展和在血栓与止血检测方面的广泛应用，使得血栓与止血的检测从传统的手工方法发展到全自动凝血仪，从单一的凝固法发展到免疫学方法、生物化学方法，止血与血栓的检测也因此而变得简便、准确、精确[2]。

目前，凝血仪已广泛应用于临床实验室。

当代较先进的血液凝聚分析仪器，能同时应用不同的实验原理对大量的标本进行多项指标的检测；与此同时，仪器对标本和试剂的需求比手工方法几乎减少一半，极大地降低了检测成本[3]。

大家已了解到现代止血与血栓检验范围正在日益拓展，除了对出血性疾病的筛选与确诊外，还用于对各种血栓性疾病与血栓前状态的检测与预测，血栓症的评价，DIC的实验诊断以及对各种抗凝治疗患者的用药指导和愈后估计[4]。

总之，在血液病、糖尿病、高脂血症、心脑血管病、心胸外科治疗等领域的研究诊断与治疗方面，止血与血栓检查均具有重要作用。

目前，这一类检验的工作量很大，在发达国家估计已占血液学检验的1/3。

在发展中国家，凝血仪的开发研究，具有极大的潜力和广泛的发展前景。

§1-2 凝血检测系统的研究现状
1-2-1 凝血检测的方法及原理
1. 生物学方法(Biology)
生物学方法(凝固法)即将凝血因子激活剂加入到待检血浆中，使血浆发生体外凝固，凝血仪连续记录血浆凝程中的一系列变化(如光、电、机械运动等)，并将这些变化信号转变成数据，用计算机收集、处理数据后得出检测结果[5]。

这类方法发展最早，使用最广泛。

目前，在凝血仪中使用的凝固法大致可
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分成三类：电流法(也称钩方法)、粘度法(也称磁珠法)、光学法。

（1） 光学法
这是当前凝血仪中使用最多的一种检测方法。

一束光通过样品杯会发生透射和散射。

样品杯中的血浆在凝固过程中，纤维蛋白原逐渐转变成纤维蛋白，其理学性状也会发生改变，透射光和散射光的强度也会发生改变。

凝血仪根据这种由于血液凝固而导致光强度的变化来判断凝固终点的方法称之为光学法。

光学法又可分成两种：散射比浊法和透射比浊法。

① 散射比浊法：即根据待检样品在凝固过程中散射光的变化来确定凝固终点的检测方法。

来自发
光二极管的光被样品所反射或散射，散射光又被一光电二极管接收，仪器将光强度转变成电信号，这些电信号再被传送到一个监测器进行处理。

当然，发射光的二极管同接收光的光电二极管必须成一定角度。

② 透射比浊法：即根据待检样品在凝固过程中吸光度的变化来确定凝固终点的检测方法。

透射比
浊法的原理同散射比浊法的原理基本相似。

来自光源的光经平行光管后变成平行光，此平行光透过待检样品后照射到一光电传感器上变成电信号，经过放大再被传送到一个监测器上进行处理。

（2） 电流法
即是将待测样品作为电路的一部分，由于纤维蛋白原无导电性而纤维蛋白具有导电性，可以利用凝血过程中电路电流的变化来判断纤维蛋白的形成。

（3） 粘度法(磁珠法)
即在待检样品加入小磁珠，利用变化的磁场使小铁珠产生运动，随着血浆的凝固，血浆粘度增加，小铁珠的运动强度逐渐减弱，仪器根据小铁珠运动强度的变化确定凝固终点[6，7]。

2. 生物化学法(bigchemistry)
生物化学法主要是通过测定发色物质的吸光度变化，以推算待测物的含量。

其基本原理是：首先人工合成某种酶裂解物的化合物，且化合物与发色物质，如与对硝基苯胺(PNA)相连接。

待检样品中含有活性酶(原)或经样品中加入过量酶激活剂，在检测过程中发色物质被解离下来，被检样品中出现颜色变化，它与被检物质含量呈数量关系。

生物化学法以酶学方法为基础，可直接定量，所需样品量小，测定结果准确、重复性好，便于自动化和标准化。

凝血仪日前使用发色物质检测的指标大致分为3种模式，即对酶、酶原和酶抑制物进行测定。

3. 免疫学方法(immunology)
免疫学方法是以被检测物质作为抗原，然后用免疫动物的方法制备相应的抗体，利用抗原体的特异性结合反应来对被检测物质进行定量。

止血与血栓实验应用的免疫方法很多，包括免疫扩散法、免疫电泳、酶联免疫吸附实验和免疫比浊等。

但自动凝血仪多采用免疫比浊法。

免疫比浊既可以通过透射比浊，也可以通过散射比浊。

虽然目前凝血仪使用免疫比浊法检测的实验室指标不多，但它作为一种新发展起来的方法，为其它实验室指标的自动化检测提供了一种新的途径。

4. 干化学技术(dry reagent technology)
这类分析方法主要用于床旁凝血分析。

其原理是：用惰性顺磁铁氧化颗粒（paramagnetic iron oxide particles， PIOP）均匀分布并结合于可产生凝固或纤溶反应的干试剂中。

PIOP 可在一固定垂直磁场作2
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用下移动。

当血标本通过毛细管作用进入反应层后，可溶解干试剂，并发生相应的凝固或纤溶反应，同时与试剂结合的PIOP在反应过程中通过其移动或摆动幅度的大小而提供。

纤维蛋白形成或溶解的动力学特征。

PIOP 摆动所产生的光量变化通过光电检测器记录。

然后通过信号放大、转换、计算而得到检测结果。

5. 超声分析(ultrasonic method)
这是一类利用超声波测定血浆体外凝固过程中血浆发生变化的半定量方法。

在凝血分析过程中，以频率为2.0MHz 至2.7MHz 的石英晶体传感器作为信号的发射器和接受器。

当血浆与相应试剂作用时，血浆凝固过程可使石英传感器的发射波产生相应的变化，通过接收、记录和分析这种变化而得到相应的结果。

目前此方法使用较少[8]。

1-2-2 凝血仪的简介
凝血仪按自动化程度可分为半自动及全自动两种，前者主要检测一般的常规凝血项目，后者则有自动吸样、稀释样品、检测、结果储存、数据传输、结果打印、质量控制等功能，除对凝血、抗凝、纤维蛋白溶解系统的功能进行全面的检测外，尚能对抗凝、溶栓治疗进行实验室检测。

半自动凝血仪：目前市售的半自动凝血仪主要由样品、试剂预温槽、加样器和检测系统（光学、磁场）及微机所组成。

全自动凝血仪的基本构成包括：样品传送及处理装置、试剂冷藏位、样品及试剂分配系统、检测系统、电子计算机、输出设备及附件等。

全自动凝血仪的特点是加样、预温、检测及报告结果全部自动化，如CA 6000、STA、MDA 180、Futura、MIA1600C等，这些仪器大致具有检测速度快、检测方法多样等特点，而且加样的自动化避免了人工操作的力度、方位等对实验结果的影响，但是全自动凝血仪开发成本昂贵。

半自动的凝血仪加样需用手工，检测方法和检测速度都很有限，但其具有操作简便，价格便宜等特点，如CAl00、CArrYon Ⅳ、ST4、Fibrintimer等。

有些半自动的凝血仪如Coachrome，既有凝固法，又有产色底物法分析，适用于中小型血栓与止血实验室。

另外，还有一类使用全血的小型凝血仪，如TAS。

将血液滴入检测卡的样品孔，血液即可沿着一定的管道系统流动，凝血仪监测血液的流动来判断凝固终点。

这类仪器由于使用全血及检测卡，所以较适用于床边检测。

1-2-3 当前凝血仪的性能特点
1．检测速度快、检测项目齐全：目前广泛使用的全自动凝血仪的检测速度多在50-300 次(测试)／h，最快的可选700 次(测试)／h；检测的项目除常规的凝血筛选实验外，可进行单个凝血、抗凝、纤溶系统因子的检测，也可以进行抗凝及溶栓疗法的监测。

2．活性与抗原性同时检测：目前有的全自动凝血仪除了利用血浆凝固法和发色底物法进行有关因子活性检测外，尚可利用免疫比浊的原理进行这些因子的抗原含量测定。

3．检测通道、同时检测的项目：性能优越的凝血仪多有4个检测通道，同时检测的项目可以多达l0个。

4．标本及试剂位：全自动凝血仪一般有超过50个标本位，有的还设有急诊位可以使紧急标本优先检测。

条形码的运用使仪器对标本及所需检测项目进行快速识别。

性能优越的凝血仪设有多达20个l5℃的试剂位，可以满足多个检测同时进行的需求。

由于配备了盖帽贯穿式进样机，有的仪器检测时可以不打开样品管，从而使检测的自动化程度又有提高。

3
微流控分析芯片用于凝血检测的实验研究
4 5．结果的储存、传递：计算机技术的应用使仪器可以进行大量检测数据的储存(10000个)，通过特
定的接口可以使检验结果迅速传递到各临床科室。

1-2-4 当前凝血仪存在的问题
通过对凝血仪的调查研究，我们发现凝血仪中存在着一些问题：
1.手工和半自动测量仪器的测量一部分是手工操作，人工配置试剂，过程复杂，操作繁琐，精度不高，
随机误差大，工作效率不高[9]。

2.另一部分自动仪器的测量方法（比如磁珠法）和以前的比浊法来说，其抗干扰能力不是很强，测量
精度不是很高，灵敏度也不是很高[10]。

3.测量仪器的测量结果不能标准化且可比性差。

4.当前使用比浊法原理测量的仪器，多数抗干扰能力不足或者抗干扰能力与其价格很不相匹配[11]。

5.现在的测量仪器大部分都使用单色光源，不能满足不同检测项目需要不同波长光源的要求，因此它
们所能测试项目比较少，不能满足医院多方面的要求。

6.反应容器没有加入搅拌，试剂混合不均匀，因而测量结果也较不准确。

7.当前使用的软件开发系统复杂难懂，数据的存储量很少，同时由于软件固化在硬件仪器中，因此仪
器的功能不易修改，升级非常繁琐。

§1-3 微流控芯片的原理与应用
微流控分析芯片(microfluidic analysis chip)技术是20世纪90年代由瑞士的Widmer和Manz提出的，它是通过微细加工技术在约为几平方厘米的芯片上构建储液池、微反应室、微管道、微检测元件等微功能元器件，从而构成具有微流路控制的分析系统[12]。

所以，也称为微全分析系统(micro total analysis system)；芯片上的实验室(lab-on-a-chip)等[13]。

微流控芯片具有微型化、集成化、便携化、自动化、低成本和低损耗等诸多优点，这些优点也确保了其在众多领域的广阔的应用前景，譬如，生物医学、高通量药物合成筛选、农作物的优选优育、环境监测与保护、卫生检疫、司法鉴定研究等众多领域[14]。

其中，生物医学是当前微流控芯片的主要应用领域，如用于临床检验的微流控芯片在我国拥有最广泛的市场。

与传统检测方法相比，微流控芯片可以在一块芯片上同时对多个病人进行多种疾病的检测；无需机体直接参与免疫应答反应，能实现早期诊断；能检测病源微生物种类，甚至微生物的亚型等。

而且待测试样用量小，灵敏度和可靠性极高，检测成本低，自动化程度高。

这些特点使得医务人员能够在短时间内，掌握大量的疾病诊断信息，从而帮助医生在短时间内找到正确的治疗措施。

该项技术发展迅速，应用领域不断扩展，已经引起国内外学术界和研究机构的高度重视。

目前全球基于微流控技术产品的年利润以20%的年增长率迅速突破了150亿欧元[15]。

近几年来，随着基础与应用基础研究的深入，微流控芯片的产业化进程显著加速。

1999年后一些商品化微流控分析设备相继问世。

许多发达国家，如美国、德国、荷兰、瑞典、丹麦等，均有新兴的公司积极进入了这一领域的开发研究，抢占市场[16]。

我国在微流控分析方面的研究虽然起步较国外晚了4~5年，但在多个相关的学科领域都具有足够的积累与优势。

我国具有世界上最大的微流控芯片市场，用中国的微流控芯片产业占领
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这一市场、提高微流控芯片新的经济增长点是我国科学家责无旁贷的使命。

为了保证这一目标的实现既需要扎实的基础与应用基础研究，又需要不断开发新的微流控芯片产品。

§1-4 本论文的主要研究内容
本论文的研究工作主要包括以下几个方面：
一、对凝血检测的各种方法及相应的原理进行研究，对凝血检测系统的总体方案进行分析和研究。

二、根据检测原理对检测装置的机械部分进行了研究和改进，选择了微流控芯片来替代传统的玻璃试管作为检测容器，以改进用玻璃试管检测时所存在的问题，提高精度和可靠性。

三、对检测系统的硬件部分分析与改进，提高系统的可靠性和稳定性。

四、研究操作软件设计方案，完成软件设计，实现软件操作的方便，快捷和智能。

优化参数检测算法设计，提高数据处理的精度与可靠性。

五、完成大量有效的实验。

进行实验分析，验证系统性能。

实验结果表明采用微流控芯片作为检测容器与传统玻璃试管相比，试剂混合均匀，能去除透镜效应，且实验一致性好。

整套检测系统具有操作简单、易于生产、非接触检测、不受自然光干扰影响、精度高、准确性高、具有很强的信号智能化分析处理功能等优点。

软件设计上采用了虚拟仪器，它的优点是使用灵活，可视性强，性价比高，易于功能升级。

本课题旨在采用微流控芯片作为检测容器，最大限度地把加试剂、反应、检测等分析功能集成为一体。

该检测系统的研究成功将进一步促进我国医学检测技术的发展，同时，将加快微流控芯片的产业化，为分析仪器提供新的经济增长点。

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第二章凝血检测系统总体方案设计
§2-1 检测系统的基本工作原理
本检测系统检测的项目主要为凝血四项检测，包括凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)、纤维蛋白原(FIB)、凝血酶时间(TT)等的检测。

这些检测项目需要利用两种不同波长的光源进行检测，同时利用圆盘形的微流控芯片作为检测容器，如图2.1所示，首先，在靠近芯片圆心的贮液池R1中加入凝结剂，芯片外周的贮液池R2中加入血浆，那么在芯片旋转时凝结剂在离心力的作用下被甩向芯片外周，最终与R2中的血浆混合。

由此，该结构可在芯片旋转过程中完成试样试剂混合、反应等操作。

同时，运用能发射红光和蓝光的双光束二极管为恒定光源，光束透过R2，在其下表面有硅光电池接收光信号。

在与凝结剂均匀混合后，血浆由于发生一定的理化反应而凝结，光信号也会随之发生改变。

硅光电池将光信号的变化转换成电信号的变化，经采集可显示整个凝结过程电信号，经数据处理后计算，可得到需要的信息。

如凝固时间、凝固过程曲线、按指定数学方法计算后的曲线等。

图2.1采集部分装置示意图
Fig. 2.1 Demonstration of the data acquireing part
该种方法的最大特点是：无损纤维，不受自然光干涉影响，可捕捉凝固过程的细微变化，精度高，准确性较好。

§2-2 检测项目与检测方法
本课题将完成凝血四项检测，即凝血酶原时间（PT）、活化部分凝血活酶时间（APTT）、纤维蛋白原（FIB）、凝血酶时间（TT）的检测。

凝血四项检测对人体凝血系统分析及临床止血，凝血障碍性疾病的诊断，治疗和检测等具有重要意义。

尤其对播散性血管内凝血（DIC）的抢救和溶栓治疗有重要的价值。

各检测项目的检测原理如下：。