人的外周血淋巴细胞培养

内容摘要：

各种生物的染色体数目是恒定的，大多数高等动物是二倍体，即每一个细胞含有两组同样的染色体，染色体是显微镜下可见细胞有丝分裂过程中出现的结构，是遗传物质的载体,携带着丰富的遗传信息。[1]在人类，只有精子和卵子是单倍体，其他细胞都是双倍体。如果一个人类胚胎部分染色体为多倍体，多数不能正常发育，但如果是性染色体是多倍体（XXX或XYY）、三套第21对染色体（唐氏综合症）、三套第18对染色体（爱德华氏症）、三套第13对染色体（巴陶氏症），则有机会长大成人。[2]实验掌握人体微量血液体外培养制备染色体标本的方法。人外周血液中的小淋巴细胞，几乎都在 G1期（或G0期），一般情况下是不再分裂的，当在培养液中加入植物凝血素（PHA）时，这种小淋巴细胞受刺激转化为淋巴母细胞，使其恢复增殖能力，随后进入有丝分裂。经过短期培养，秋水仙素的处理，低渗和固定，就可获得大量的有丝分裂细胞，从而进行核型分析。通过实验发现，人类每个体细胞有46条染色体，22对常染色体和1对性染色体。本方法已为临床医学、病毒学、药理学、遗传毒理学等方面广泛应用。

关键词：外周血培养、低渗技术、组型分析

引言：

正常人类染色体的数目为46条(23对)，1960年的Denver会议和1963年的London会议制定了统一的人类染色体命名体制：按照染色体的相对长度、臂比和着丝粒指数，将常染色体（22对）按大小用阿拉伯数字标记，顺次排列为1～22号，性染色体用X和Y标记；并按染色体大小和着丝粒位置，把人类染色体分为七个组，用大写字母A～G表示。

染色体经显带处理后，每条染色体都显示出其特定的形态特征，根据这些特征，可以对染色体进行组型分析。

本次实验在操作过程中，主要采用了外周培养技术和低渗技术。

外周血培养是将外周血接种在适当的培养物中加入适量的秋水仙素，使纺锤体微管解聚，这样细胞停留在中期，可以获得大量的分裂细胞。用低渗盐溶液（一般是0.075mol/L的KCl）处理，使其中的红细胞及分裂相细胞膜和一部分细胞质除去，最后以气干法制片，可获得较好的染色体养基中进行培养。人类外周血细胞本来是终末分化细胞，一般没有分裂能力，但经PHA（植物血球凝集素）或ConA等药物刺激后，转变成可分裂的转化细胞。通过许多学者的改进和革新，培养基由天然的动物血浆改为合成培养基，促进细胞生长的物质从胎汁改为动物血清，本实验中用的小牛血清。体外培养技术已经广泛应用在杂交瘤技术制备单克隆抗体，动物细胞的大规模培养，微生物制药技术，基因转染与细胞融合以及细胞转化工程技术等方面。[3]

低渗处理的目的是使水分通过细胞膜向细胞内渗入，导致转化的淋巴细胞，染色体进一步分散而利于分析。同时，低渗处理还可使红细胞质膜破裂，经后血影浮于上清中被去除，后续的固定过程主要针对淋巴细胞，改善了淋巴细胞的固定质量及标本质量。[4]

1.实验材料与用品：

1.1材料：

人的外周血淋巴细

1.2 实验药品：

RPMI“1640”培养基肝素秋水仙素植物凝血素(PHA) 硫酸链

（蓝季科技发展有限公司，5g，2-8℃保存）青霉素（蓝季科技发展有

限公司，0 .8g,2-8℃保存）保存吉姆萨染液0.1mol/L磷酸缓冲液

1.3 药品配置：

以下药品按20人份来配置：

1.3.1 RPMI“1640”培养基：称取“1640”粉末0.84g，用80ml的双蒸水溶

解，如溶液中出现浑浊或难以溶解时，可用干冰或CO2气体处理，如pH

值降至6.0时，则可溶解而透明。每80mL溶液加NaHCO30.088g，以干

冰或CO2气体矫正pH至7.0--7.2。

1.3.2 肝素：作为抗凝剂使用。称取该粉末mg（126单位/mg），用mL生理盐

水溶解，此溶液的浓度为L500单位/mL。[5]

1.3.3 秋水仙素：作为有丝分裂的阻止剂，它能改变细胞质的粘度，抑制细胞分

裂时纺锤体的形成，使细胞分裂停留在中期。称取秋水仙素0.01g溶于333mL生理盐水中，此时秋水仙素的浓度为30mg/L，置于冰箱4℃保存。

使用时取该溶液0.1mL加入5mL的培养物中，其最终浓度为0.6mg/mL。[6]

1.3.4 植物凝血素（PHA）:是淋巴细胞有丝分裂刺激剂。取2支针剂加4mL蒸

馏水溶解，每人用0.2mL。

1.3.5 小牛血清

1.3.6 双抗：青霉素（每瓶80万单位）、链霉素（每瓶500万单位）,以每1mL

生理盐水溶解10万单位青霉素来溶解。（100万单位=1g）

1.3.7 0.075mol/LKCl溶液:称取KCl粉末0.56克，用100毫升蒸馏水溶解，

终浓度为0.075摩尔／升。

1.3.8 固定液：甲醇：冰醋酸=3：1。

1.3.9 0.9%生理盐水：称取0.9g的氯化钠，溶解于100mL的蒸馏水中。

1.4 实验用具：

离心管、培养瓶、试管、试管夹、试管架、吸管、玻璃棒、烧杯、酒精

灯、镊子、烧杯、载玻片、pH试纸、毛细吸管、高速冷冻离心机

(ROTANTA 460R 德国)、电子分析天平（梅特勒-托利多仪器上海有限

公司，AB204-N）、恒温培养箱（青岛海尔特种电冰柜有限公司，HRHS24）、显微镜（XS-212-201 JNOEC）、恒温水浴锅（青岛海尔特种电冰柜有

限公司，HRHS24）、冰柜（青岛海尔特种电冰柜有限公司，BD-255LTA）

2.实验方法：

2.1培养液的分装：

配置好20人份后，进行分装，每瓶量为：

培养液（RPMI1） 4mL

PHA 1mL

肝素 0.2mL

双抗（青霉素加链霉素） 0.05mL