目的基因获取

（二）真核生物基因的组成
➢基因区：ATG + extrons + introns + TAA（TGA或 TAG） ➢转录启动区：编码蛋白的启动子( RNA聚合酶Ⅱ识别) 可寻找三个保守区：TATAA/TA区（Hogness框）、 CAAT框、GC框。 ➢转录终止区:真核生物转录的终止信号并不清楚。
第四章 目的基因的获得
目的基因
➢准备要分离、改造、扩增或表达的基因。
编码某种蛋白质
研究某基因与疾 病的关系
研究某基因结构和 功能的关系
一、基因的基本结构特征
一个能转录、翻译的结构基因依次包括 以下几部分：转录启动区、核糖体识别区 、编码区(包括起始密码子ATG、开放阅读 框、终止密码子TAG、TAA或TGA)和转录 终止区。
二、目的基因的获得方法
➢目前克隆目的基因常用的方法有四种方法 ：化学合成法、cDNA文库法、PCR法和 RT-PCR法 。
（一）化学合成法
➢将已知序列的目的基因利用化学合成的方法直 接合成。
➢特点：①只能合成小于100个碱基特定序列； ②自动化程度较高；③合成速度较快。
➢ 方法：磷酸二酯法、磷酸三酯法、固相亚磷 酸三酯法
➢基因特异性引物法：mRNA序列已知，设计 基因特异性引物，在反转录酶的作用下合成 cDNA第一链。
4. 降解mRNA模板
➢用碱处理或用RNaseH降解mRNA-DNA杂
交分子中的mRNA。
3’
mRNA
5’
5’ 引物
cDNA
反转录酶 3’
3’
mRNA
5’
5’ 引物
cDNA第一链
3’
碱 或RNaseH
3. cDNA第一链的合成
➢Oligo dT法：用Oligo dT作引物，合成 cDNA的第一链。
3’AAAAAAA
mRNA
5’
5’TTTTTTT cDNA 反转录酶
Oligo dT引物 不适用于大分子量的mRNA
➢随机引物法：随机合成6-10bp的多种引物， 从mRNA的多个位点开始合成cDNA。
5’ 引物
cDNA第一链
3’
5. cDNA第二链的合成
➢自身引导法 用RnaseH 消化后，cDNA单链的3’末端一 般形成一个弯回来的双链发卡结构（机理 不明），可成为合成第二条cDNA链的引物 。用DNA聚合酶合成第二链DNA。
S1核酸酶消化会使获得的双链cDNA 5’端 有几对碱基缺失
➢置换合成法
mRNA
目的基因 的引物1
反转录成目的基因cDNA第一链
目的 基因cDNA第二链
PCR
目的基因 的引物2
获取目的基因方法的选择策略
类 型
已知的信息
获得目的基因的方法
已知目的基因的部分序列或其他 1 物种中同源基因的保守序列
PCR相关的技术简便、快速地获得全长的目的 基因 已知的目的基因部分片段为探针从基因文库中 筛选。
➢提取基因组DNA作模板； ➢根据目的基因序列设计引物； ➢PCR扩增。
适合扩增原核生物基因。
原核细胞
提取基因组DNA
原核基因组部分
PCR扩增
2. 从mRNA中扩增: RT-PCR
➢提取基因组总RNA； ➢反转录合成总cDNA作模板； ➢根据目的基因序列设计引物； ➢PCR扩增。
适合扩增真核生物基因。
➢cDNA文库：利用某种生物的总mRNA合成 cDNA，再将这些cDNA与载体连接，转入细菌 细胞中进行保存和扩增，称cDNA文库。
基因组DNA文库与cDNA文库的比较
基因组DNA文库
cDNA文库
构建cDNA文库的一般步骤
1. 总RNA（total RNA）提取 ➢ 提取总RNA有商业化的试剂盒（kit）。 ➢ mRNA约占总RNA的1－5％，所以应选用目
2 已知基因表达的蛋白产物
制备抗体通过免疫学方法筛选表达型cDNA文库 对蛋白N端测序后,以氨基酸序列反推核昔酸序 列,或标记为寡聚核昔酸探针筛选基因文库或设计 简并引物通过PCR相关技术获得目的基因
（一）原核生物基因的组成——操纵子
➢ 启动子：RNA聚合酶识别、结合和开始转录的片段； ➢ SD区：糖体16S rRNA识别、结合mRNA的位置； ➢ 转录终止子和终止因子：分别指基因或操纵子3’ 端提
供转录终止信号的DNA序列；协助mRNA聚合酶识别 终止信号的辅助蛋白。 ➢ 原核的终止子在终止点之前有一回文结构，转录物形 成茎环发夹 。
接上人工接头
粘性末端
末端转移酶 CCC
CCC
cDNA文库的查询
➢用目的基因探针与文库中的重组载体进行 Southern blot杂交。
文库 载体 探针
Βιβλιοθήκη Baidu
测序分析
电泳后杂交放射 自显影
（三）PCR法
➢目前实验室最常用。 ➢扩增时容易突变：高保真的PCR引物，
DNA序列测定。
1. 直接从基因组中扩增
化学合成法的用途
➢合成天然基因：如生长激素释放抑制素基因、 脑啡肽基因、胰岛素基因、干扰素基因等
➢修饰改造基因：如组织型纤溶酶原激活剂基因 、尿激酶原基因等
➢设计新型基因 ➢制备探针、引物、接头
（二）cDNA文库法
➢cDNA (complementary DNA，互补DNA)：由 生物的某一特定器官或特定发育时期细胞内的 mRNA经体外反转录后形成的互补DNA。
以第一链合成产物cDNA-mRNA杂交 体作为切口平移的模板，RNA酶H在杂交 体的mRNA链上造成切口和缺口,产生一系 列RNA引物，在DNA聚合酶I的作用下合 成cDNA的第二链.
置换合成法
6. cDNA与载体连接 ➢在双链cDNA末端接上人工接头，即可与载 体连接，转入受体菌。
➢或借助末端转移酶给载体和双链cDNA的3’ 端分别加上几个C或G，成为粘性末端。
的基因mRNA表达最丰富的组织细胞为材料 来源，如获胰岛素基因，由应以胰岛β细胞为 原始生物材料，细胞因子基因应选用经抗原 或丝裂原刺激培养的淋巴细胞为材料
2. mRNA的分离纯化
➢原理：利用mRNA都含有一段polyA尾巴， 将mRNA从总RNA（rRNA、tRNA等）中 分离纯化。
➢方法：亲和层析。分离mRNA用商业化的 Oligo dT纤维柱。