第四章-第一讲-预处理、提取、细胞破碎

提取方法
提取对象
稀盐溶液
稀酸溶液
在低浓度盐溶液中溶解度较大的酶
在稀酸溶液中溶解度大且稳定的酶
稀碱溶液
稀有机溶剂
在稀碱溶液中溶解度大且稳定的酶 与脂质结合牢固或含较多非极性基团 的酶
1、稀盐溶液
麸皮曲中提取a-淀粉酶、 糖化酶、蛋白酶
0.15mol/L的NaCl溶液、 0.02~0.05mol/L的磷酸盐缓冲液 0.1mol/L的MgCl2
固液分离。 方法：（1）加热：适用于耐热的酶，加适当酶保护剂 （2）加凝聚剂或絮凝剂
凝聚：CaCl2、 FeCl3、明矾等 絮凝：聚丙烯酰胺、壳聚糖、 明胶等
（3）调pH值
发酵液
预处理 细胞分离 细胞破碎 细胞碎片分离 初步分离 纯化 成品加工 （ 胞 外 酶 ）
二、分离纯化的一般流程
发酵液 预处理
超声波破碎的适用范围
超声波破碎是很强烈的破碎方法，适用于多数微生物
的破碎。
超声波破碎的有效能量利用率极低，操作过程产生大
量的热，因此操作需在冰水或外部冷却的容器中进行。 由于对冷却的要求相当苛刻，所以不易放大，主要用 于实验室规模的细胞破碎。
（三 ）化学破碎法

通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞破碎的方 法。 有机溶剂：如甲苯，丙酮，丁醇，氯仿等。 非离子型表面活性剂：吐温、催通等。
人干扰素是一种重要蛋白类生物药品，具有
抗癌和治疗肝炎等作用。 Yonehara等人： 醋酸锌盐析
（83.0%）
离子交换层析
（62.7%）
硫酸铵盐析
（96.2%）
铜螯合层析
（46.0%）
疏水层析
（78.3%）
凝胶电泳
（88.9%）
共六步，总收率仅为16%
Staehelin等人： 硫酸铵盐析 免疫亲和层析 阳离子交换层析
离心分离、凝胶过滤、膜分离 盐析沉淀、有机溶剂沉淀、共沉淀、 等电点沉淀 离子交换层析、电泳分离、等电聚焦 疏水层析 亲和层析、免疫电泳、免疫沉淀 热变性技术、酸碱选择性变形技术、 表面变性控制技术等
疏水特性
亲和作用 外界因素
纯化方法选择的总体原则
1、判断采用的方法和条件是否得当，始终以检测 指标为参考标准; 2、应对被纯化的酶的理化性质有一个比较全面的 了解; 3、在纯化工作中，往往不宜重复采用相同的步骤 和条件； 4、要严格控制操作条件。
（四）酶促破碎法
（1）自溶法（自身酶） （2）酶处理（外加酶）
微生物种类
细菌 酵母 霉菌 植物细胞
Байду номын сангаас
酶
溶菌酶
β -葡聚糖酶
几丁质酶
纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶
细胞破碎的主要阻力来自于细胞壁，不同类型的微生物其细胞 壁的结构特性是不同的。
微生 物 壁厚 革兰氏 阳性细菌 革兰氏 阴性细菌 酵母菌 真菌
胞壁酸 蛋白质 脂多糖(1-4%)
•破碎难易程度：酵母（70nm）﹥细菌[革兰氏阳性菌（15-50nm）﹥阴性菌（10nm）]
细胞破碎方法及其原理
机械破碎
通过机械运动产生的剪切 力，使组织、细胞破碎。
捣碎法 研磨法 匀浆法 温度差破碎法 压力差破碎法 超声波破碎法 有机溶剂 表面活性剂
物理破碎
通过各种物理因素的作用， 使组织、细胞的外层结构破 坏，而使细胞破碎。
第四章
酶的分离纯化及产品成型
第四章 酶的分离纯化及产品成型
本章知识点： （1）细胞的破碎、酶的提取 重点（2）酶的分离纯化：沉淀分离、离心 分离、膜过滤、层析分离、电泳分离 （3）酶液的浓缩、结晶、干燥、成型 监 （ 测 ） 酶 纯 化 过 程 的 4
酶制剂生产全过程
培养基 灭菌 菌种 培养
过程控制和优化
枯草杆菌碱性磷酸酶
2、稀酸或稀碱溶液
胰脏中提取胰蛋白酶 和胰凝乳蛋白酶
0.12mol/L的H2SO4 pH11~12.5的碱液
3、稀有机溶剂
大豆脲酶
细胞色素氧化酶、琥珀 酸脱氢酶、胆碱酯酶等
细菌的L-天冬酰胺酶
32%丙酮
4、水
植物酯酶、霉菌脂肪酶等
（二）提取过程中的注意事项
序号 1 2 3 4 影响因素 pH值 温度 注意事项 不超出酶的酸碱稳定范围； 最好远离待提取酶的等电点。 0~10℃左右，尤其是采用有机溶剂提取时
提取液体积 为含酶原料体积的2~5倍。可一次抽提， （用量） 也可分几次反复抽提 加保护剂 提高酶的稳定性
工业上使用的细胞破碎器械：大容量球磨机、高 压匀浆器。
珠磨机
加工后的细胞匀浆
细胞悬浮液
阀座
碰撞环
阀杠
高压匀浆器
（二） 物理破碎法

通过温度，压力，声波等各种物理因素的作用，将组织 细胞破碎的方法。 冻融法、压差法、超声波法。
超声波破碎的机理
一般认为在超声波作用下液体发生空化作用
（cavitation)，空穴的形成、增大和闭合产生极大的 冲击波和剪切力，使细胞破碎。超声波的细胞破碎效率 与细胞种类、浓度和超声波的声频、声能有关。
线路1
细胞分离（离心、过滤）
线路2
细胞 （胞内酶）
细胞破碎
清液（胞外酶）
碎片分离
粗分离 纯化 成品化
二、细胞破碎—只对胞内酶
P85
（1）机械破碎法
（2）物理破碎法
超声波 细胞破碎机
（3）化学破碎法
（4）酶促破碎法
高 压 细 胞 破 碎 机
电动玻璃匀浆机
细 胞 破 碎 珠
（一）机械破碎法

利用机械力的搅拌，剪切或研碎细胞。 组织捣碎机，细胞研磨器，匀浆器等。
培养液（发酵液）
成品
上游技术
下游技术
1) 2) 3) 4)
培养液（发酵液）的预处理； 初步纯化（提取）； 高度纯化（精制）； 成品加工。
第一节 概述
一、生物下游加工技术
下游加工过程包括目标产物的提取、浓缩、纯化及 成品化等过程。
大多数酶的回收纯化过程成本约占70%； 医用酶的生产回收过程的成本高达85%； 基因工程表达产物回收纯化过程成本一般占85-90%以上； 青霉素回收过程成本约占50%； 乙醇的回收过程成本仅占14%。
二、分离纯化的一般流程
发酵液 预处理
线路1
细胞分离（离心、过滤）
线路2
细胞 （胞内酶）
细胞破碎
清液（胞外酶）
碎片分离
粗分离 纯化 成品化
发酵液
预处理 提 取 提取
P48
预处理 细胞分离 细胞破碎 细胞碎片分离 初步分离 （ 胞 外 酶 ）
精制 成型
精 制
纯化 成品加工
第二节 酶的提取分离（酶溶液的制备）
仅三步，总收率达81.0%
纯化方法选择的总体原则
1、判断采用的方法和条件是否得当，始终以检测 指标为参考标准;
纯化方法选择的总体原则
1、判断采用的方法和条件是否得当，始终以检测 指标为参考标准; 2、应对被纯化的酶的理化性质有一个比较全面的 了解;
酶分离纯化方法
分离依据的性质 分子大小、轻重 溶解度差异 电荷性质 分离方法
含水多，产物含量低； 含菌体蛋白；溶有原来 培养基成分；相当多的 副产物和色素；易被杂 菌污染或使产物进一步 分解；易起泡，粘性物 质多。
过程控制和优化
培养基 灭菌 菌种 培养
培养液（发酵液） 下游技术
成品
上游技术
第二节 酶的提取分离（酶溶液的制备） 一、发酵液的预处理
BF-7658产a-淀粉酶发酵 液的预处理：在搅拌下 加无水CaCl20.8%,升温 目的：改变发酵液的物理性质，降低粘度，便于 至50~55℃，保温半小时
化学破碎
通过各种化学试剂对细胞 膜的作用，而使细胞破碎
酶促破碎
通过细胞本身的酶系或外 加酶制剂的催化作用，使 细胞外层结构受到破坏
自溶法 外加酶法
三、酶的提取
指在一定的条件下，用适当的溶剂处理含 酶原料，使酶充分溶解到溶剂中的过程，又称 抽提。
原料
酶
溶剂
（一）提取方法
四稀：稀盐、稀酸、稀碱、稀有机溶剂，水。
20-80 nm
单层
10-13 nm
多层
肽聚糖 (5-10%) 脂蛋白 脂多糖(11-22%) 磷脂 蛋白质
100-300nm
多层
葡聚糖(30-40%) 甘露聚糖(30%) 蛋白质(6-8%) 脂类(8.5-13.5%)
100250nm
多层
多聚糖 (80-90%) 脂类 蛋白质
层次
主要 肽聚糖(40-90%) 组成 多糖