1-Axon公司膜片钳系统的漏减分析

Axon 公司膜片钳系统的漏减分析3

刘振伟,李立君,刘传缋

(军事医学科学院毒物药物研究所,北京　100850)

摘要目的和方法:采用大鼠海马脑片盲法膜片钳的全细胞记录技术,研究美国Axon 公司生产的膜片钳系统(Ax 2

opatch 放大器和pClamp 软件)中几种漏减功能的意义和作用机制,重点对定标P/N 漏减(Scaled P/N leak subtrac 2tion )、膜片钳放大器漏减以及Clampfit 处理软件漏减功能的选择与使用进行分析与比较。结果:Clampex 采样软件中的定标P/N 漏减功能比P/N 漏减功能的噪声要小;放大器漏减功能可漏减单一去极化电压幅度所诱发的漏电流,但不能同时对不同电压幅度系列去极化所产生的稳态漏电流进行追踪漏减;Clampfit 漏减功能由于其设定只要膜两侧存在电位差就有漏电流产生,因而不适合在记录电压门控性离子通道电流时对稳态漏电流进行漏减。结论:在研究电压门控性离子通道的性质时,可采用P/N 漏减功能或定标P/N 漏减功能对稳态漏电流进行漏减,而Clampfit 漏减功能是不合适的。关键词:　漏减;　海马脑片;　盲法全细胞记录中图分类号:Q424文献标识码:A 文章编号:100026834(2003)0120098204

　3收稿日期:2001212229;修回日期:2002209228

作者简介:刘振伟(19662),男,黑龙江大兴安岭人,助理研究员,博士,主要从事神经生理学与神经药理学研究。

漏电流(Leak current )是指细胞膜内外电压差发生变化(如给予去极化或超极化脉冲刺激)时,膜电容产生的被动充放电反应和膜电阻产生的被动反应电流。前者为瞬变漏电流(Transient leak cur 2rent ),后者为稳态漏电流(Steady 2state leak cur 2rent ),它们均属于线性非离子通道电流。由于在记录离子通道电流的同时也会记录到漏电流,因此必须将其去除,这样才能准确地反映流经离子通道的电流。美国Axon 公司的膜片钳系统(Axopatch 膜片钳放大器和pClamp 信号采集处理软件)提供了三种消除漏电流的方法,即:(1)膜片钳放大器电容补偿(Capacitance compensation )和漏减(Leak sub 2traction )功能;(2)Clampex 采样软件中的P/N 漏减功能以及派生出的定标P/N 漏减功能(Scaled P/N subtraction );(3)Clampfit 处理软件中的漏减功能。有关P/N 漏减功能前曾详细报道[1],本文采用海马脑片盲法全细胞记录技术重点对P/N 漏减中的定标P/N 漏减功能和其它两种漏减功能进行了较为详细的观察与分析,研究中发现,Clampfit 处理软件中的漏减功能不适合在记录电压门控性离子通道电流时对稳态漏电流进行漏减。1　材料与方法

参照文献及本实验室以往的脑片盲法膜片钳全细胞记录技术[2～4]。选用出生20～30d 的Wistar 雄性大鼠,乙醚麻醉下断头取脑,在4℃氧饱和的人工脑脊液(artificial cerebrospinal fluid ,ACSF )中剥离出

海马,用振动切片机沿长轴将海马切成厚为400

μm 的薄片,置于ACSF 中室温(20～25℃

)孵育1h 待用。ASCF 成分(mmol/L ):NaCl 124,KCl 3.3,KH 2

PO 41.2,NaHCO 326,CaCl 22.5,MgSO 41.2,葡萄糖10,p H 7.3。用氧混合气(95%O 2+5%CO 2)饱和。

为便于观察稳态漏电流的漏减效果,本实验在

ACSF 中加入了河豚毒素(TTX ,0.001mmol/L )以阻断高幅度的Na +电流。记录时将脑片放入浴槽中,用氧饱和ACSF 浸没并持续灌流(流速2ml/min )。解剖镜下选CA1区细胞线行盲法全细胞记录。记录电极尖端直径1～2μm 、充灌电极液后阻抗为2～5M Ω。电极液成分(mmol/L ):KCl 140,Hepes 10,EGTA 10,p H 7.4。由膜片钳放大器(Ax 2opatch 21D )拾取的步阶脉冲电流信号经Digidata 1200输入计算机,通过Clampex 7采样软件采入,用Clampfit 8和Origin 5.0软件进行分析作图。

2　结果

2.1　Clampex 的定标P/N 漏减功能

Clampex 采样软件中的P/N 漏减功能可对漏

电流进行实时跟踪监测并予以去除,但其主要缺点就是增大了采样信号的噪声[2]。当P/N 漏减功能所带来的噪声难以接受时,可采用定标P/N 漏减的方法。此法是基于P/N 漏减功能的原理而设计的,首先要测定出漏电流的大小,然后再将漏电流从记录电流中去除。其关键步骤是必须将参数模式Mode/Rate 中的Run 设为多个,使所测量的漏电流不是累加值而是平均值,因而降低了噪声。图1A 中3个去极化步阶脉冲中的漏电流分别由3个超极

化漏减脉冲(含10个Run )来测定,经Clampfit 中Arithmetic/Expression 功能分别将漏电流乘4,最后通过相加功能(因漏减脉冲与步阶脉冲的方向相反)获得漏减后的离子通道电流。从图1C 和1D 中可见,定标P/N 漏减与P/N 漏减的效果基本上是一致的,且其所带来的噪声比P/N 漏减的要小(当P/N 漏减噪声较大时,差别会更显著)

。

Fig.1Scaled leak subtraction function

A :Three leak currents were measured by subtraction trial ;

B :Step 2pulse currents without any leak subtraction ;

C :Step 2pulse currents with P/N leak subtraction ;

D :Ste p 2pulse cur 2rents after scaled leak subtraction of Clam pfit.The waveform in D is for B ,C ,D.and calibration in D is for all graphs

212　放大器漏减功能

膜片钳放大器电容补偿用于去除瞬变漏电流,

而其漏减功能则用于去除稳态漏电流,其施加在封接破膜形成全细胞记录模式后(图2)。值得注意的是,为使漏减更为准确,必须在信号放大情况下进行漏减。目前对于Axopatch 200B 或1D 放大器,前面板上的漏减功能只能去除5mV (Axopatch 200B )或20mV (Axopatch 1D )去极化所产生的稳态漏电流,但如采用pClamp 8采样软件的封接测试(Seal Test )功能,则可去除不同去极化幅度的稳态漏电流(最大可达295mV )。显然,放大器漏减功能可漏减单一去极化幅度所诱发的漏电流,不能同时对不同幅度系列去极化所产生的稳态漏电流进行追踪漏减。图3C ,D 中显示的是采用Axopatch 1D 放大器对20mV 去极化产生的漏电流进行漏减的情况,其中图3D 为过度漏减所造成的错误情形。

显然,较之P/N 漏减功能,膜片钳放大器的漏减功能不会引入额外噪声(比较图3B 和3C ),但由于其存在着上述明显的缺点,在测定电压门控性离子通道电流性质(如对其进行I 2V 曲线测定)时,就不能采用这种漏减方法

。

Fig .2Implement of leak subtraction of patch 2clamp amplifier

Axopatch 1D.20mV depolarizing step 2pulses ,given by Axopatch 1D to ins pect seal ,was recorded using an oscillo 2scope

A :G igoseal formation ;

B :Whole 2cell configuration ;

C :Af 2

ter capacitance compensation of Axopatch 1D ;D :After leak subtraction and capacitance compensation of Axopatch 1D

2.3　Clampf it 漏减功能

如果在采样前未进行漏电流的去除,或者发现P/N 漏减功能所带来的噪声难以接受时,也可采用Clampfit 处理软件中的漏减功能进行采样后的漏减。它用来去除稳态漏电流,这一点不同于P/N 漏减功能(对瞬变漏电流和稳态漏电流都能有效去除)。Clampfit 漏减功能的原理是先计算出膜被动反应电阻,即漏电阻(Leak resistance ,R leak ),然后求出稳态漏电流并予以去除。R leak 值根据欧姆定律算出,其测定必须在离子通道没有被激活的状态下进行,因此这就要求在采用步阶脉冲时,必须围绕钳制膜电位水平进行小幅度的漏电流测试。研究中发现,虽然Clampfit 漏减功能和P/N 漏减功能去除的均为线性漏电流成分,但这两种漏减功能所采用的机制是不同的。Clampfit 漏减功能认定当膜电位为0mV 时没有漏电流产生,只要膜电位不为0mV (即膜两侧存在电位差),就认为有漏电流存在。P/N 漏减功能则认定当膜电位为钳制膜电位时没有漏电流产生,只要膜电位偏离钳制膜电位(如给予去极

化脉冲刺激),即认为就有漏电流产生,两者去除漏电流的尺标不同。从图4可以看出,两者漏减机制的不同造成其漏减的效果也不同,对于Clampfit 漏减功能,膜电位在0mV 附近时,漏电流较小;而对于P/N 漏减功能,膜电位偏离钳制膜电位而接近0