10 过氧化氢酶米氏常数的测定
过氧化氢酶米氏常数的测定
过氧化氢酶米氏常数的测定一、实验目的了解并掌握米氏常数的意义和测定方法二、实验原理H2O2被过氧化氢酶分解出H2O和O2，未分解的H2O2用KMnO4在酸性环境中滴定，根据反应前后H2O2的浓度差可求出反应速度。
2H2O2 = 2H2O + O22KMnO4 + 5H2O2 + 3H2SO4 = 2MnSO4 + K2SO4 + 5O2↑ + 8H2O本实验由马铃薯提供过氧化氢酶。
在保持恒定的条件下，用相同浓度的过氧化氢酶催化不同浓度的H2O2分解。
在一定限度内，酶促反应速度与H2O2浓度成正比。
用双倒数作图法(即以1/v对1/[S]作图)可求得过氧化氢酶的Km值。
三、实验器材锥形瓶(6个) 吸管、酸式滴定管四、实验试剂1、0.02mol/L 磷酸缓冲液(pH=7)2、0.004 mol/L KMnO4(需标定)3、0.05 mol/L H2O2(需标定)4、25% H2SO4五、实验操作1、酶液的提取：称取马铃薯（去皮）5克，加0.02mol/L 磷酸缓冲液10mL，再加少量海砂，研磨成匀浆，离心(3000r/ min，10min)，上清液即为酶液。
2、滴定：取干燥锥形瓶6只，按下表顺序加入试剂：先加好0.05mol/L H2O2及蒸馏水，加酶液后立即混合，依次记录各瓶的起始反应时间。
各瓶时间达5min时立即加2.0mL 25% H2SO4终止反应，充分混匀。
用0.004 mol/L KMnO4滴定各瓶中剩余的H2O2至微红色，记录消耗的KMnO4体积。
六、实验计算分别求出1─5瓶的底物浓度[S]和相应的反应速度v。
C1V110[S] =5 ∕2C2V2C1V1–v =式中 [S]：为底物物质的量浓度(mol/L)C1：为H2O2物质的的量浓度(mol/L)V1：为H2O2的体积(mL)10：反应的总体积v：反应速度(mmol/min)C2: KMnO4物质的量浓度(mol/L)V2：KMnO4的体积(mL)以1/v对1/[S]作图求出Km。
过氧化氢酶动力学常数测定
过氧化氢酶动力学常数测定实验项目二、过氧化氢酶的活力和动力学常数测定姓名: 赵家熙指导教师: 谭志文实验室: 6503 组员:?章恒炯 ? ? 成绩: 第三部分:实验记录与分析一、酶活力测定,一,原始数据1.样品原始质量:5.032g2.标定数据:,1,KMnO质量数及配制:158 4,2,NaCO质量数:134 224,3,标定数据:0.02mol/L,4,KMnO实际浓度:0.019mol/L 43.样品滴定数据消耗高锰酸钾溶液,ml,:实验,1,0.65实验,2,0.50对照,1,1.45对照,2,1.30,二,结果计算1(换算系数,1mL KMnO溶液相当于多少mg HO, 4221.72.样品酶活计算,每克鲜重样品1min内分解HO的毫克数表示:mg 22HO/g•min, 22().ABV,，，T171酶活(mgH2O2/g?min)= FWVt，，,A-B,=0.8 V=20.25 FW=5.032 V=2.5ml t=10min T1酶活(mgH2O2/g?min)=0.218二、动力学常数的测定,一,原始数据编号1 2 3 4 5 消耗的0.10 0.10 0.40 0.30 0.30 KMnO,mL, 4,二,求出各管反应前的底物浓度[S]和反应速度V 00编号1 2 3 4 50.005 0.0067 0.0082 0.0125 0.0250 [S],mol/L,00.0099 0.0124 0.0126 0.0221 0.0471 V,mmol/min,0,三,以1/V对1/[S]作图,用excel作图, 001/s 200 149.2 121.9 80 40 1/v 111.1 80.6 79.3 45.1 21.2,四,求出Km,mol/L,和Vmax,mmol/min,1K1m,，如,三,中图 vv[S]vmaxmaxy=0.5572x+1.5829 x=0时 y=1/Vmaxy=0时 x=-1/Km Km=0.35 Vmax=0.63第四部分:课后研讨题 1.总结本实验操作过程的注意事项。
过氧化氢酶动力学常数测定
过氧化氢酶动力学常数测定实验项目二、过氧化氢酶的活力和动力学常数测定姓名: 赵家熙指导教师: 谭志文实验室: 6503 组员:?章恒炯 ? ? 成绩: 第三部分:实验记录与分析一、酶活力测定,一,原始数据1.样品原始质量:5.032g2.标定数据:,1,KMnO质量数及配制:158 4,2,NaCO质量数:134 224,3,标定数据:0.02mol/L,4,KMnO实际浓度:0.019mol/L 43.样品滴定数据消耗高锰酸钾溶液,ml,:实验,1,0.65实验,2,0.50对照,1,1.45对照,2,1.30,二,结果计算1(换算系数,1mL KMnO溶液相当于多少mg HO, 4221.72.样品酶活计算,每克鲜重样品1min内分解HO的毫克数表示:mg 22HO/g•min, 22().ABV,，，T171酶活(mgH2O2/g?min)= FWVt，，,A-B,=0.8 V=20.25 FW=5.032 V=2.5ml t=10min T1酶活(mgH2O2/g?min)=0.218二、动力学常数的测定,一,原始数据编号1 2 3 4 5 消耗的0.10 0.10 0.40 0.30 0.30 KMnO,mL, 4,二,求出各管反应前的底物浓度[S]和反应速度V 00编号1 2 3 4 50.005 0.0067 0.0082 0.0125 0.0250 [S],mol/L,00.0099 0.0124 0.0126 0.0221 0.0471 V,mmol/min,0,三,以1/V对1/[S]作图,用excel作图, 001/s 200 149.2 121.9 80 40 1/v 111.1 80.6 79.3 45.1 21.2,四,求出Km,mol/L,和Vmax,mmol/min,1K1m,，如,三,中图 vv[S]vmaxmaxy=0.5572x+1.5829 x=0时 y=1/Vmaxy=0时 x=-1/Km Km=0.35 Vmax=0.63第四部分:课后研讨题 1.总结本实验操作过程的注意事项。
过氧化氢酶米氏常数
过氧化氢酶米氏常数各位读友大家好，此文档由网络收集而来，欢迎您下载，谢谢篇一：过氧化氢酶动力学常数测定实验项目二、过氧化氢酶的活力和动力学常数测定姓名：赵家熙指导教师：谭志文实验室：6503 组员：①章恒炯②③成绩：第三部分：实验记录与分析一、酶活力测定（一）原始数据1.样品原始质量：2.标定数据：（1）KMnO4质量数及配制：158 （2）Na2C2O4质量数：134 （3）标定数据：/L（4）KMnO4实际浓度：/L3.样品滴定数据消耗高锰酸钾溶液（ml）：实验（1）实验（2）对照（1）对照（2）（二）结果计算1．换算系数（1mL KMnO4溶液相当于多少mg H2O2）2.样品酶活计算（每克鲜重样品1min内分解H2O2的毫克数表示：mg H2O2/g?min）(A?B)?VT??V1?t酶活(mgH2O2/g·min)=酶活(mgH2O2/g·min)=（A-B）= VT====10min二、动力学常数的测定（一）原始数据（二）求出各管反应前的底物浓度[S]0和反应速度V0（三）以1/V0对1/[S]0作图（用excel 作图）1/s 1/v2008040（四）求出Km（mol/L）和Vmax （mmol/min）Km11?? vv[S]v如（三）中图maxmaxy=+ x=0时y=1/Vmaxy=0时x=-1/KmKm= Vmax=第四部分：课后研讨题1.总结本实验操作过程的注意事项。
1酶的提取和存放一般在0-4℃下进行。
2每个三角瓶内的酶促反应时间要精确控制在5min。
3各反应瓶的滴定终点微红色为同一标准。
4使用前应检查滴定管是否渗漏，滴定过程中应该保证逐滴加入。
2.影响过氧化氢酶活力测定的因素有哪些?1、温度，温度过高或者过低会降低过氧化氢酶的活性。
2、酸碱度，酸或碱浓度太高会使过氧化氢酶失活。
3.过氧化氢酶与哪些生化过程有关?R(Fe2+)+H2O2 = R(Fe3++OH－) R(Fe3+OH－)2+H2O2 = R(Fe2+)2+2H2O+O24.在反应速度的测定中，加入硫酸有哪些作用？终止反应,为下一步的滴定提供酸的环境。
过氧化氢酶米氏常数的测定实验报告
过氧化氢酶米氏常数的测定实验报告各位小伙伴，今天咱们要聊一聊那个神奇的小东西——过氧化氢酶。
它可是我们体内消化食物、排除废物的小能手，没有它，我们的肚子可能会闹别扭哦！说起过氧化氢酶，大家可能听说过“米氏常数”这个专业名词，听起来好像很严肃的样子。
但米氏常数就是告诉我们，过氧化氢酶在特定条件下，能够多快地分解过氧化氢，达到一个平衡点。
这个平衡点就像是过氧化氢酶和过氧化氢之间的“约会时间”，决定了它们能不能顺利相遇。
咱们来做个实验，看看过氧化氢酶的“约会时间”到底有多少。
实验很简单，就是测量过氧化氢在不同浓度下的反应速度，然后根据数据计算出米氏常数。
听起来是不是有点像侦探破案？没错，这就是我们用科学的方法，去揭开过氧化氢酶这个神秘面纱的过程。
实验开始啦！我们要准备一些过氧化氢溶液和酶溶液。
记得哦，过氧化氢溶液是无色的液体，里面含有双氧水分子，它能和氧气反应产生氧气和水。
而酶溶液呢，就像是一位神奇的魔法师，它能催化过氧化氢分解成水和氧气。
我们将酶溶液加入到过氧化氢溶液中，摇一摇，让两者混合均匀。
这时，我们的眼睛就要发挥超级侦探的作用了，我们要仔细观察反应的速度变化。
比如，当过氧化氢浓度较低时，反应速度会慢一些；当过氧化氢浓度较高时，反应速度就会加快。
实验过程中，我们还要记录下不同浓度下的反应时间。
这些时间就像是一个个小故事，记录着过氧化氢酶和过氧化氢之间的故事进展。
通过一系列的实验数据，我们可以计算出米氏常数。
这个数值就像是过氧化氢酶和过氧化氢之间的“约会时间”，告诉我们它们能否顺利相遇。
如果数值越大，说明过氧化氢酶和过氧化氢更容易相遇；如果数值越小，说明它们相遇的难度就大一些。
我们可以根据计算出来的米氏常数，预测过氧化氢酶在不同浓度下的反应情况。
这就像是给过氧化氢酶开了一张“约会时间”的时间表，让它知道什么时候该出现，什么时候该消失。
通过这次实验，我们不仅学会了如何测量米氏常数，还明白了过氧化氢酶在生物体中的重要角色。
过氧化氢酶米氏常数
[标签:标题]篇一：过氧化氢酶动力学常数测定实验项目二、过氧化氢酶的活力和动力学常数测定姓名：赵家熙指导教师：谭志文实验室：6503 组员：①章恒炯②③成绩：第三部分：实验记录与分析一、酶活力测定（一）原始数据1.样品原始质量：5.032g2.标定数据：（1）KMnO4质量数及配制：158 （2）Na2C2O4质量数：134 （3）标定数据：0.02mol/L （4）KMnO4实际浓度：0.019mol/L3.样品滴定数据消耗高锰酸钾溶液（ml）：实验（1）0.65实验（2）0.50 对照（1）1.45 对照（2）1.30（二）结果计算1．换算系数（1mL KMnO4溶液相当于多少mg H2O2）1.72.样品酶活计算（每克鲜重样品1min内分解H2O2的毫克数表示：mg H2O2/g?min）(A?B)?VT?1.7FW?V1?t酶活(mgH2O2/g·min)=酶活(mgH2O2/g·min)=0.218（A-B）=0.8 VT=20.25FW=5.032V1=2.5mlt=10min二、动力学常数的测定（一）原始数据（二）求出各管反应前的底物浓度[S]0和反应速度V0（三）以1/V0对1/[S]0作图（用excel作图）1/s 1/v200 111.1149.2 80.6121.9 79.380 45.140 21.2（四）求出Km（mol/L）和Vmax（mmol/min）Km11?? vv[S]v如（三）中图maxmaxy=0.5572x+1.5829 x=0时y=1/Vmaxy=0时x=-1/KmKm=0.35 Vmax=0.63第四部分：课后研讨题1.总结本实验操作过程的注意事项。
1酶的提取和存放一般在0-4℃下进行。
2每个三角瓶内的酶促反应时间要精确控制在5min。
3各反应瓶的滴定终点微红色为同一标准。
4使用前应检查滴定管是否渗漏，滴定过程中应该保证逐滴加入。
过氧化氢酶的活力和动力学常数测定 - 生化实验技术
酶促反应速度可用单位时间底物的减少量表示，即求
出单位时间内反应前后H2O2浓度差，即可计算出酶促 反应速度。
米氏方程的倒数形式，即双倒数作图法
（LineweaveR-Burk法）如下：
1 Km 1 v0 vmax[S ] vmax
2
3
4
5
1.25 1.67 2.50 5.00
8.25 7.83 7.0 4.5
各瓶分别加好H2O2和蒸馏水后，再依次加入酶液 0.5mL，混匀，记录各瓶起始反应的时间。反应5min 后立即加入25% H2SO4 2.0mL终止反应，
2.滴定
用0.004mol/L KMnO4滴定各瓶中剩余的H2O2至微红色， 记录消耗的KMnO4溶液毫升数。
[S]为底物浓度（mol/L） v0为初速度（μmol/L*min） vmax为最大反应速度（μmol/L*min） Km为米氏常数（ mol/L）
用双倒数法（以1/v0对1/[S]作图） 计算米氏常数Km和最大反应速度vmax
三、材料、试剂与器具
1.材料：新鲜马铃薯 2.试剂： （1）10% H2SO4； （2）0.2mol/L磷酸缓冲液pH7.8；
（二）酶活力的测定
1.反应 取50ml三角瓶4个（两个测定两个对照），测定瓶中加入
酶液2.5ml，对照瓶中加入煮死酶液2.5ml，再加入2.5ml 0.1mol/L H2O2，同时计时，于30℃恒温水浴中保温 10min，立即加入10% H2SO4 2.5ml。
2.滴定 用0.02mol/L KMnＯ4标准溶液滴定H2O2，至出现粉红
实验六--过氧化氢酶米氏常数(Km)的
.
五、计算
1.反应速度的计算: 以反应消耗的H2O2 mmol数表示。
反应速度=加入的H2O2 mmol数－剩余 的H2O2 mmol数
即: H2O2 mol浓度×加入的毫升数－ KMnO4 0.004 mol/L×消耗的KMnO4 毫升数× 5/2
③底物浓度［S］=②÷5 0.01
2 1.00 0.08 0.02
3 1.50 0.12 0.03
4 2.00 0.16 0.04
5 2.50 0.20 0.05
④酶作用后，KMnO4滴定 ml
⑤剩余H2O2mmol=④ ×0.004×5/2
1.35 0.0135
3.70 0.037
6.40 0.064
实验七 过氧化氢酶米氏常
数（Km）的测定
.
一、实验目的
学习米氏常数（Km）的测定方法。
.
二、实验原理
过氧化氢酶(CAT)催化下列反应: 2H2O2→2H2O+O2↑ H2O2浓度可用KMnO4在硫酸存在下
滴定测知。 2KMnO4＋5H2O2＋3H2SO4 →
2MnSO4＋K2SO4＋5O2↑＋8H2O 求出反应前后H2O2的浓度差即为反应
2．H2O2浓度的标定: 取洁净锥形瓶两只， 各加浓度约为0.05mol/L的H2O2 2.0ml和 25%H2SO4 2.0ml，分别用0.004mol/L KMnO4 滴定至微红色。从滴定用去KMnO4ml数，求出 H2O2的mol浓度。
.
3．反应速度的测定: 取干燥洁净 50ml锥形瓶5只，编号，按下表 操作。
.
加入物(ml) H2O2(约 0.05mol/L) 蒸馏水 血液稀释液
食品酶学
第一部分 实验一、 原理1、过氧化氢酶米氏常数的测定：H 2O 2被过氧化氢酶分解出H 2O 和O 2，未分解的H 2O 2用KMnO 4在酸性环境中滴定，根据反映前后H 2O 2的浓度差可以求出反应速度。
本实验以马铃薯提供过氧化氢酶，以1/ν~1/[S]作图求Km2、黄素蛋白酶的定性试验：黄素蛋白酶是以黄素核莓酸（FMN 或FDA ）为辅基的脱氢酶类。
某些黄素蛋白酶还含有铁、铜或钼类金属离子。
分子中核黄素部分能与氢原子可逆地结合，从而引起递氢作用。
N N C NH CN O O CH 2(CHOH)3CH 2OH H 3C H 3C N H N CNH C H N O O CH 2(CHOH)3CH 2OH H 3C H 3C +2H -2H这类脱氢酶可以催化脱去底物分子中的氢氧或从还原态辅酶Ⅱ（NADH,H+及NADPH ，H+）上把氢传给氧。
在无氧条件下，可用甲烯蓝代替氧。
例如牛乳中的黄嘌呤氧化酶就是黄素蛋白酶的一种。
它能催化水合甲醛把氢交给甲烯蓝3、酵母蔗糖酶的部分纯化与酶活测定：酵母中含有丰富的蔗糖酶（EC3.2.1.26），本实验以酵母为原料，首先通过研磨法以及温度差破碎法破碎细胞的方式得到粗酶，之后先通过调节pH 到5.0杂蛋白的等电点，不影响酶活的情况下，使其凝聚沉淀，最后保温至最适温度反应后，通过测定没催化产物量来间接测定酶活。
细胞破碎方法有机械破碎法（通过机械运动所产生的剪切力的作用使细胞破碎的方法），物理破碎法（通过压力、温度、声波等各种物理因素的作用使组织细胞破碎的方法，常用的有温度差破碎法、压力差破碎法和超声波破碎法）和化学破碎法（通过各种化学试剂对细胞膜的作用使细胞破碎的方法）。
研磨法是利用研体、石磨、细菌磨、球磨等研磨器械所产生的剪切力将组织细胞破碎，必要时可以加入精制石英砂、小玻璃球、玻璃粉、氧化铝等作为助磨剂，以提高研磨效果。
研磨法设备简单、可以采用人工研磨液可以采用电动研磨。
实验二、过氧化氢酶的活力和动力学常数测定
1 0.50
2 0.67 8.83
编号 3 0.83 8.67
4 1.25 8.25
5 2.50 7.00
各瓶分别加好H2O2和蒸馏水后，再依次加入酶液 0.5mL，混匀，记录各瓶起始反应的时间。30℃反应 5min后立即加入10% H2SO4 5.0mL终止反应。
2.滴定
用0.02mol/L KMnO4滴定各瓶中剩余的H2O2至微红色， 记录消耗的KMnO4溶液毫升数。 分别求出各瓶反应前后的底物浓度[S]0、[S]1，并计算反 应速度v： [S]0为反应前的底物浓度（mol/L） [S]0=C1V1/10 [S]1为反应后的底物浓度（mol/L） [S]1=2.5C2V2/10 C1为H2O2的浓度（mol/L） v=(C1V1-2.5C2V2)/5 C 为KMnO 用液的浓度（mol/L）
结果记录 与计算
高锰酸钾溶液标定
取5mL 0.1mol/L的草酸和3mL 10% H2SO4溶液于锥形瓶中， 加热至（75～85）℃（见冒热气），趁热用KMnO4标准溶液 滴定，刚开始反应较慢，滴入一滴KMnO4标准溶液摇动，待 溶液褪色，再加第二滴KMnO4（此时生成的Mn2+起催化作 用）。随着反应速度的加快，滴定速度也可逐渐加快，但 滴定中始终不能过快，，不断摇动或搅拌。滴定至溶液呈 现微红色并持续半分钟不褪色即为终点。
与反应速度的关系
v为反应速度 [S]为底物浓度 vmax为最大反应速度 Km为米氏常数
米氏常数Km
Km等于反应速度达到最大反应速度一半时的底物浓度。 在酶学分析中， Km是酶的一个基本特征常数，它包含 着酶与底物结合和解离的性质。
Km表示酶和底物之间的亲和能力， Km值越大，亲和能 力越弱，反之亦然。
过氧化氢酶米氏常数的测定
过氧化氢酶米氏常数的测定傅璐121140012一、实验目的1. 了解米氏常数的测定方法2. 学习提取生物组织中的酶二、实验原理1.米氏反应动力学米氏方程(Michaelis-Menten Equation):2.米氏常数的意义：①反映酶的种类：Km是一种酶的特征常数，只与酶的种类有关，与酶浓度、底物浓度无关。
②米氏常数是酶促反应达到最大反应速度Vmax一半时的底物浓度。
其数值大小反映了酶与底物之间的亲和力：Km值越大，亲和力越弱，反之Km值越小，亲和能力越强。
③Km可用来判断酶（多功能酶）的最适底物：Km值最小的酶促反应对应底物就是该酶的最适底物。
3.米氏常数的求法：该方法的缺点是难以确定最大反应速度Vmax。
该作图法应用最广。
但在低浓度是v值误差较大，在[S]等差值实验时作图点较集中于纵轴。
因此在设计底物浓度时，最好将1/[S]配成等差数列，这样可使点距较为平均，再配以最小二乘回归法，就可以得到较为准确的结果。
此法优点是横轴上点分布均匀，缺点是1/v会放大误差，同时对底物浓度的选择有要求。
[S]<<Km时图形近于水平线，[S]>>Km时直线将在原点附近与轴相交。
4.氧化酶：生物体内重要的三种氧化酶类，其作用均是消除体内自由基：①POD：过氧化物酶②SOD:超氧化物歧化酶③CAT：；过氧化氢酶5.过氧化氢酶的作用：植物体内活性氧代谢加强而使过氧化氢发生积累。
过氧化氢可进行一步生成氢氧自由基。
氢氧自由基是化学性质最活泼的活性氧，可以直接或间接地氧化细胞内核酸、蛋白质等生物大分子，并且有非常高的速度常数，破坏性极强，可使细胞膜遭受损害，加速细胞的衰老和解体。
过氧化氢酶（catalase，CAT）可以清除过氧化氢、分解氢氧自由基，保护机体细胞稳定的内环境及细胞的正常生活，因此CAT是植物体内重要的酶促防御系统之一，其活性高低与植物的抗逆性密切相关。
6.过氧化氢酶活力的测定方法：①紫外吸收法：过氧化氢在240nm波长下有强烈吸收，过氧化氢酶能分解过氧化氢，使反应溶液吸光度（A240nm）随反应时间而降低。
酶的米氏常数测定实验报告
酶的米氏常数测定实验报告
酶的米氏常数是衡量酶与底物结合能力的指标之一。
下面是米氏
常数测定实验的报告：
实验目的：
通过测定酶的反应速率，确定酶的米氏常数。
实验原理：
酶促反应遵循米氏-明可夫斯基动力学（Michaelis-Menten kinetics）的规律，即将底物浓度作为独立变量，反应速率作为因变量，建立数
学模型。
该模型表达式为：
V0=Vmax×[S]÷(Km+[S])
其中，V0为反应速率，Vmax为最大反应速率，[S]为底物浓度，Km为
米氏常数。
实验步骤：
1.准备100mmol/L的底物溶液和酶液
2.取不同浓度的底物溶液，加入相同量的酶液，并在恒温水浴中反应
一定时间
3.反应结束后，停止反应，加入酶抑制剂终止反应
4.用滤纸过滤液体，取滤液用于分光光度计测定吸光度
5.将吸光度转换为底物浓度，并绘制底物浓度-V0曲线
6.通过线性回归计算得到Km值
实验结果：
假设底物的浓度为[S]，V0为反应速率，则上述式子可以改写为：
1/V0=(Km/Vmax)×(1/[S])+1/Vmax
将1/V0作为y轴，1/[S]作为x轴，绘制出图像，得到斜率为Km/Vmax，截距为1/Vmax。
通过线性回归计算得到Km为10mmol/L，Vmax为5μmol/L·min。
实验结论：
通过实验测定，得到该酶的米氏常数为10mmol/L，最大反应速率为
5μmol/L·min。
这表明该酶与底物的结合能力相对较强，但反应速率并不是特别快。
过氧化氢酶米氏常数的测定实验报告
过氧化氢酶米氏常数的测定实验报告1. 实验目的与背景哎呀，大家好！今天咱们来聊聊一个挺有趣的实验——过氧化氢酶的米氏常数测定。
别被这个名字吓到了，其实就是在研究一种酶的“工作效率”而已。
想象一下过氧化氢（H₂O₂）就像是个小小的坏蛋，它可不是什么好东西；而过氧化氢酶呢，就是那个专门来捉拿坏蛋的超级英雄。
这种酶存在于咱们的细胞里，帮忙把过氧化氢分解成水和氧气，保护我们的身体不被这些“坏蛋”害了。
米氏常数（Km）这东西呢，简单来说就是衡量酶对底物亲和力的一个参数。
如果Km值小，说明酶对底物的“喜欢”程度高，咱们的超级英雄很厉害；反之则说明这个超级英雄对底物的“兴趣”不大。
通过测定这个值，我们可以更好地理解这位超级英雄的“战斗力”，也能对相关的生物化学反应有个更清晰的认识。
2. 实验原理与方法2.1 实验原理好的，接下来咱们进入正题——实验原理。
首先，得了解酶催化的基本过程。
简单来说，酶会跟底物结合，形成一个“酶底物复合物”，然后催化底物转变为产物。
在这个过程中，酶的催化速率会受到底物浓度的影响。
米氏常数就是用来描述这种关系的一个参数。
咱们用的是过氧化氢酶，它催化的反应是这样的：2 H₂O₂ → 2 H₂O + O₂。
底物过氧化氢在反应过程中会被转化成水和氧气。
通过测定不同底物浓度下反应速率的变化，可以绘制出反应速率与底物浓度的关系图，从中找出米氏常数Km。
2.2 实验步骤接下来，就轮到实验步骤了。
首先，准备好过氧化氢酶和不同浓度的过氧化氢溶液。
每一种底物浓度都要做几个重复实验，以确保数据的可靠性。
接着，将过氧化氢酶加入到每种浓度的过氧化氢溶液中，开始反应。
然后，定期取样，测定反应产物的浓度。
这时，咱们就要用上光谱仪之类的仪器来检测氧气的产生情况，这可是个大工程，得小心翼翼地操作，别弄得一团糟。
3. 实验结果与讨论3.1 实验数据分析一切准备妥当，实验终于开始啦！拿到数据后，我们就可以用“米氏方程”来分析实验结果了。
生化实验题河南科技大学)
实验题一、判断题1．唾液淀粉酶催化淀粉水解的最终产物主要是麦芽糖。
√2．凝胶过滤法可用于分离纯化蛋白质，分子量大的蛋白质先从柱上被洗脱出来。
√3．在同一条件下进行电泳，同工酶的泳动速度是相同的。
×4．在糖原提取与鉴定实验中，糖原水溶液与斑氏试剂反应呈现砖红色沉淀。
×5．糖原水溶液遇碘作用显红棕色。
√6．生物体内DNA复制和体外DNA扩增都需要一小段RNA作为引物。
×7．凝胶过滤法可用于分离纯化蛋白质，分子量大的蛋白质先从柱上被洗脱出来。
√8．温度升高，酶促反应速度加快，温度下降，酶促反应速度变慢。
×9．蛋白质与氨基黑10B结合后，不能从醋酸纤维素薄膜上洗脱下来。
√10．在PCR中，需要合成一对RNA引物。
×11．在PCR中，需要合成一对DNA引物。
√12．饱和度MgSO4或NaCl溶液中沉淀的蛋白质只是球蛋白。
√13．饱和度(NH4)2SO4溶液中沉淀的蛋白质只是球蛋白。
×14．凝固的蛋白质可溶于稀酸或稀碱溶液中。
×15．所有的蛋白质通过加热都可发生沉淀。
×16．在0.15mol/L氯化钠溶液中脱氧核糖核蛋白的溶解度较大。
×17．核糖核蛋白在0.15mol/L氯化钠溶液中溶解度比较大。
√18．酶法测定血清甘油三酯的计算结果应减去0.11mmol/L。
√19．95%冷乙醇有利于DNA从溶液中析出。
√20．血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳，蛋白质均向正极方向泳动。
×21．Na+是唾液淀粉酶的激动剂，SO42-是抑制剂。
×22．琥珀酸脱氢酶属于不需氧脱氢酶。
√二、单项选择题1．若用重金属沉淀pI为8的蛋白质时，该溶液的pH值应为A．8 B．＞8C．＜8 D．≥8 E．≤82．将乳清蛋白、淀粉、胃蛋白酶、唾液淀粉酶和适量水混合装入一容器内，调整pH值至1.8保温于37℃的水浴箱内，过一段时间后容器内剩余的物质是A．淀粉、胃蛋白酶、多肽、水B．乳清蛋白、唾液淀粉酶、麦芽糖、水C．胃蛋白酶、唾液淀粉酶、麦芽糖、水D．唾液淀粉酶、麦芽糖、葡萄糖、水E．乳清蛋白、唾液淀粉酶、淀粉、胃蛋白酶、水3．用Sephadex G-50分离血红蛋白和甲稀兰的层析方法是A．凝胶层析B．离子交换层析C．亲和层析D．高效液相层析4．本学期所做的琼脂糖凝胶电泳是用来分离A．蛋白质B．核酸C．脂蛋白D．糖5．醋酸纤维素薄膜电泳分离血清蛋白时，各血清蛋白的泳动速度由大到小依次是A．α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白、白蛋白B．α1-球蛋白、α2-球蛋白、白蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白C．白蛋白、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白D．γ-球蛋白、β-球蛋白、α2-球蛋白、α1-球蛋白、白蛋白6．在琼脂糖凝胶电泳中，使核酸在紫外透射仪下显色的是A．氨基黑B．溴酚蓝C．二甲苯氰D．溴化乙锭7．一个基本的PCR反应体系包括A．模板、Taq DNA聚合酶、PCR Buffer、Mg2+、引物、dNTPs、去离子水B．模板、DNA-polⅡ、PCR Buffer、Ca2+、引物、dNTPs、去离子水C．模板、DNA-polⅡ、PCR Buffer、Mg2+、引物、dNTPs、水D．模板、Taq DNA聚合酶、PCR Buffer、Ca2+、引物、dNTPs、水三、填空题1．722s型分光光度计使用前预热的目的是_______________________。
生物化学过氧化氢酶Km值测定
思考题
酶米氏常数的测定会受到那 些实验条件的影响？
15
5、25% H2SO4
9
四、实验步骤 1、酶液的制备：
每组(共分6组)称取马铃薯5g， 加磷酸缓冲液 10mL，研钵匀浆， 滤纸过滤。
10
2、反应速度的测定：取干燥的50-100ml锥形瓶 6只，编号后按下表操作：
试剂（mL） 0
H2O2溶液/mL 0 蒸馏水/mL 9.5
1
2
3
4
5
1.00 1.25 1.67 2.50 5.00 8.50 8.25 7.83 7.00 4.50
3、0.004mol/L KMnO4：称取恒重草酸钠0.2 g，加
250mL冷沸水及10mL浓硫酸，用0.02mol/L
KMnO4 滴定至至微红色，加热至65 ℃，继续滴
定微红色30s不褪，算出KMnO4的准确浓度稀释成
0.004mol/L即可。
8
5Na2C2O4+2KMnO4+8H2SO4=10CO2↑+2Mn SO4+K2SO4+8H2O+5Na2SO4
过氧化氢酶米氏常数的测定
生物化学实验
1
一、实验目的
了解米氏常数的意义，测定过 氧化氢酶的米氏常数。 学习一种测定酶Km值的方法 熟悉和掌握过氧化氢酶活性的 测定原理和方法
2ห้องสมุดไป่ตู้
二、相关知识与原理 相关知识 米氏方程与米氏常数（Km值）
米氏方程
Ｖ ── ＝ Vmax[S] Km + [S]
Km值: 酶促反应速度为Vmax/2时的 底物浓度。单位是mol/L
酶液/mL
0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50
[笔记]过氧化氢酶动力学常数测定
![[笔记]过氧化氢酶动力学常数测定](https://img.taocdn.com/s3/m/0899a2c7192e45361166f5a1.png)
[笔记]过氧化氢酶动力学常数测定实验项目二、过氧化氢酶的活力和动力学常数测定姓名: 赵家熙指导教师: 谭志文实验室: 6503组员:?章恒炯 ? ? 成绩:第三部分:实验记录与分析一、酶活力测定,一,原始数据1.样品原始质量:5.032g2.标定数据:,1,KMnO质量数及配制:158 4,2,NaCO质量数:134 224,3,标定数据:0.02mol/L,4,KMnO实际浓度:0.019mol/L 43.样品滴定数据消耗高锰酸钾溶液,ml,:实验,1,0.65实验,2,0.50对照,1,1.45对照,2,1.30,二,结果计算1(换算系数,1mL KMnO溶液相当于多少mg HO, 4221.72.样品酶活计算,每克鲜重样品1min内分解HO的毫克数表示:mg 22HO/g•min, 22().ABV,，，T171酶活(mgH2O2/g?min)= FWVt，，,A-B,=0.8 V=20.25 FW=5.032 V=2.5ml t=10min T1酶活(mgH2O2/g?min)=0.218二、动力学常数的测定,一,原始数据编号1 2 3 4 5 消耗的0.10 0.10 0.40 0.30 0.30 KMnO,mL, 4,二,求出各管反应前的底物浓度[S]和反应速度V 00编号1 2 3 4 50.005 0.0067 0.0082 0.0125 0.0250 [S],mol/L,00.0099 0.0124 0.0126 0.0221 0.0471 V,mmol/min,0,三,以1/V对1/[S]作图,用excel作图, 001/s 200 149.2 121.9 80 40 1/v 111.1 80.6 79.3 45.1 21.2,四,求出Km,mol/L,和Vmax,mmol/min,1K1m,，如,三,中图 vv[S]vmaxmaxy=0.5572x+1.5829 x=0时 y=1/Vmaxy=0时 x=-1/Km Km=0.35 Vmax=0.63第四部分:课后研讨题1.总结本实验操作过程的注意事项。
最新-过氧化氢酶米氏常数 精品
过氧化氢酶米氏常数篇一：过氧化氢酶动力学常数测定实验项目二、过氧化氢酶的活力和动力学常数测定姓名：赵家熙指导教师：谭志文实验室：6503组员：①章恒炯②③成绩：第三部分：实验记录与分析一、酶活力测定（一）原始数据1样品原始质量：50322标定数据：（1）4质量数及配制：158（2）224质量数：134（3）标定数据：002（4）4实际浓度：00193样品滴定数据消耗高锰酸钾溶液（）：实验（1）065实验（2）050对照（1）145对照（2）130（二）结果计算1．换算系数（14溶液相当于多少22）172样品酶活计算（每克鲜重样品1内分解22的毫克数表示：22?）(?)??17?1?酶活(22·)=酶活(22·)=0218（-）=08=2025=50321=25=10二、动力学常数的测定（一）原始数据（二）求出各管反应前的底物浓度[]0和反应速度0（三）以10对1[]0作图（用作图）112001111149280612197938045140212（四）求出（）和（）11??[]如（三）中图=05572+15829=0时=1=0时=-1=035=063第四部分：课后研讨题1总结本实验操作过程的注意事项。
1酶的提取和存放一般在0-4℃下进行。
2每个三角瓶内的酶促反应时间要精确控制在5。
3各反应瓶的滴定终点微红色为同一标准。
4使用前应检查滴定管是否渗漏，滴定过程中应该保证逐滴加入。
2影响过氧化氢酶活力测定的因素有哪些?1、温度，温度过高或者过低会降低过氧化氢酶的活性。
2、酸碱度，酸或碱浓度太高会使过氧化氢酶失活。
3过氧化氢酶与哪些生化过程有关?(2+)+22=(3++－)(3+－)2+22=(2+)2+22+24在反应速度的测定中，加入硫酸有哪些作用？终止反应,为下一步的滴定提供酸的环境。
5米氏方程中的有何实际应用？米氏常数是酶促反应速度为最大酶促反应速度值一半时的底物浓度。
可用于判断反应级数；判断是否为不同种酶；判断酶的最适底物；确定酶活性测试时所需底物的浓度。
过氧化氢酶米氏常数的测定实验报告的实验讨论
过氧化氢酶米氏常数的测定实验报告的实验讨论同学们，今天咱们来唠唠这个过氧化氢酶米氏常数的测定实验的讨论部分啊。
这实验就像是一场探索之旅，我们在微观的生物化学世界里摸爬滚打。
在做这个实验的时候啊，那可真是状况百出。
你知道吗？就像一场没有剧本的戏，全靠我们自己摸索。
刚开始的时候，我觉得测量那些反应速度就像是在追赶一只调皮的小老鼠，它总是跑来跑去，很难准确抓住。
我们用各种仪器，小心翼翼地操作，可有时候数据还是会出现一些奇怪的波动。
也许是仪器在跟我们开玩笑呢，哈哈。
从实验结果来看啊，这个米氏常数的值是有一定范围的。
但是我就想啊，这个值真的就那么准确吗？我觉得可能存在一些误差。
比如说，我们在配置底物溶液的时候，可能会有一丢丢的偏差。
就像做菜放盐，多一点少一点可能味道就不太一样，这里溶液浓度稍微有点偏差，可能就影响了最后的结果。
再说说这个实验方法。
我们采用的这种测定方法虽然是比较经典的，但就像一件旧衣服，可能有一些不合身的地方。
也许有其他新的方法可以让这个实验更精准呢？我就在想，如果能有一种像魔法一样的高科技手段，一下子就能精确地测定出米氏常数，那该多好啊。
还有啊，实验中的环境因素。
这就像天气对人的心情影响一样。
温度、pH值这些环境因素在实验中就像是隐藏的小怪兽，悄悄地影响着实验结果。
我们在控制这些因素的时候，可能并没有做到完美。
我记得有一次，实验室的温度好像有点不稳定，我当时就担心这会不会像一阵乱风吹乱了我们的实验数据呢。
不过呢，虽然有这么多的问题和可能存在的误差，但这个实验还是很有意义的。
它就像一个小小的窗口，让我们窥探到了生物化学中酶与底物相互作用的神秘世界。
我们在这个过程中学会了思考、解决问题，也明白了科学实验不是一帆风顺的，就像人生一样，充满了各种意想不到的挑战。
那大家在做这个实验的时候有没有类似的感受呢？是不是也觉得这个米氏常数就像一个神秘的宝藏，我们还需要更多的探索才能真正揭开它的全貌呢？咱们又来聊这个过氧化氢酶米氏常数的测定实验啦。
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本实验以鼠肝匀浆中的过氧化氢酶为例，测定其 Km值和Vm值。
过氧化氢酶
2H2O2
2H2O + O2
2KMnO4 + 5H2O2 + 3H2SO4
2MnSO4 + K2SO4 + 5O2↑ + 8H2O
过氧化氢酶催化H2O2分解成H2O和O2； 反应后剩余的H2O2用KMnO4在酸性溶液中滴定；
通过滴定KMnO4的消耗量求出反应前后H2O2的浓度差 即为反应速度v；
试剂 (ml)
0.04mol/L H2O2 H2O
肝匀浆液1:500
10％H2SO4
记录0.02mol/L KMnO4用量 底物浓度[S] (mmol/L) 反应速度v (mmol/10min) [S]/v (10min/L)
1号瓶 2号瓶 3号瓶 4号瓶 5号瓶
25
20
15
10
5
0
5
10
15
20
放入37℃水浴5分钟
v
Vmax[S] =K─m─+─[S─]
Vmax：最大反应速度 Km：米氏常数
初速率 v
80 Vm
60
Vm 40 2
动力学曲线
20
K
m
0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
底物浓度 [S]
Km值：可通过对米氏方 程 作 图 (V~[S] 图 ) 求 出 。 在数值上等于酶促反应 速度为最大速度一半时 的底物浓度值。单位是 mol/L(或mmol/L)。
0.01
0.015
0.0218 0.025
0.02 v/[S] (L/10min)
14
*Excel直线作图
Excel 直线作图
直接从坐标点读出：
Km = 25 mmol/L Vm = 0.545 mmol/10min
0.6 v (mmol/10min)
0.5 0.4 0.3
(25, 0.545)
0.2
肝匀浆液1:500
10％H2SO4
记录0.02mol/L KMnO4用量 底物浓度[S] (mmol/L) 反应速度v (mmol/10min) [S]/v (10min/L)
1号瓶 2号瓶 3号瓶 4号瓶 5号瓶
25
20
15
10
5
0
5
10
15
20
放入37℃水浴5分钟
1
1
1
1
1
分别加入，准确记时10分钟
[S]/v (10min/L) 120
y = 1.8277x + 45.854 100
80
60
40
—Km–
Vm
=
46
20
–Km = –25
[S] (mmol/L)
–30 –25 –20 –15 –10 –5 0 5 10 15 20 25 30 35 40
汉氏作图
11
*Excel汉斯作图
Excel 汉氏作图
试剂 (ml)
0.04mol/L H2O2 H2O
肝匀浆液1:500
10％H2SO4
记录0.02mol/L KMnO4用量 底物浓度[S] (mmol/L) 反应速度v (mmol/10min) [S]/v (10min/L)
1号瓶 2号瓶 3号瓶 4号瓶 5号瓶
25
20
15
10
5
0
5
10
15
20
放入37℃水浴5分钟
12
*Excel双倒数作图
Excel 双倒数作图
(–1/Km＝–0.04,0)
-0.1
-0.05
9 1/v (10min/mmol)
8 7 6 5 4 3 2 (0,1/Vm＝1.83) 1
0
0.05
y = 45.786x + 1.8311
Km = 25 mmol/L Vm = 0.546 mmol/10min
将米氏方程两边取倒数再乘以[S]即为汉斯方程：
v
Vmax[S] =K─m─+─[S─]
方程式两 边取倒数 再乘以[S]
[S]
──v =
──1Vm. [S]
+
──
Km Vm
(汉斯方程式)
[S]
──v
斜率
=
1 ─Vห้องสมุดไป่ตู้m
K─Vm─m
–Km
0
汉斯方程作图
[S]
4
3. 鼠肝过氧化氢酶测定化学反应原理
3. 鼠肝过氧化氢酶测定化学反应原理
1号瓶 2号瓶 3号瓶 4号瓶 5号瓶
25
20
15
10
5
0
5
10
15
20
放入37℃水浴5分钟
1
1
1
1
1
分别加入，准确记时10分钟
5
5
5
5
5
0.02mol/L KMnO4滴定
13.38 9.96 6.77 3.84 1.43
说明：① 试剂加量要准确；
② 每个三角瓶可分别保温，但要准确计时。
③ 10％H2SO4液可事先准备好，到时直接倾入。
10
3. 计算 ④ 汉斯方程作图求Km值和Vm值
④ 汉斯作图
汉斯方程： —[Sv]–
=
—Km– Vm
+
—1– Vm
•
[S]
以[S]为横坐标，[S]/v 为纵坐标，制作[S]/v ~[S]坐标图。将测定各点连成一直
线，并向纵轴方向延长与横轴相交，交点为横截距，即–Km 。纵截距为Km / Vm 。
从坐标图查得 –Km = –25，即：Km = 25 mmol/L 。 从坐标图查得 Km / Vm = 46，将Km值代入求得：Vm = 0.543 mmol/10min 。
1
1
1
1
1
分别加入，准确记时10分钟
5
5
5
5
5
0.02mol/L KMnO4滴定
13.38 9.96 6.77 3.84 1.43
38.462 30.769 20.377 15.385 7.692
0.331 0.302 0.262 0.208 0.129
9
③ 计算各管[S]/v
3. 计算
③ 计算各管[S]/v值(10min/L)填入下表
y = 1.8277x + 45.854
140 [S]/v (10min/L)
120 100
Km = 25 mmol/L Vm = 0.543 mmol/10min
80
60
40
—Km–
Vm
=
46
20 –Km = –25
-35 -30 -25 -20 -15 -10 -5 0
[S] (mmol/L) 5 10 15 20 25 30 35 40 45
③ 取1:10的匀浆液1ml，用pH7.0的磷酸缓冲液稀释 定容至50ml(1:500)。
6
2. 反应速度测定
2. 反应速度测定
取干燥的100ml锥形瓶5只，编号，按下表操作。
试剂 (ml)
0.04mol/L H2O2 H2O
肝匀浆液1:500
10％H2SO4
记录0.02mol/L KMnO4用量
1/[S] (L/mmol)
0.1
0.15
0.2
13
*Excel-Eadie-Hofstee作图
Excel-Eadie-Hofstee 作图
-0.005
0.6 v (mmol/10min)
0.545 0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
0.005
y = -25.051x + 0.5467
Km = 25 mmol/L Vm = 0.545 mmol/10min
1
1
1
1
1
分别加入，准确记时10分钟
5
5
5
5
5
0.02mol/L KMnO4滴定
13.38 9.96 6.77 3.84 1.43
38.462 30.769 20.377 15.385 7.692
0.331 0.302 0.262 0.208 0.129
116.198 101.885 88.248 73.964 59.862
④ KMnO4用量记录精确度：0.01
7
3. 计算
3. 计算 ① 计算各管底物浓度
① 按下式计算各管底物浓度(mmol/L)填入下表
[S] (mmol/L) =
H2O2 浓度(mmol/L) × 加入H2O2的体积(ml) 26ml(反应液总体积)
试剂 (ml)
0.04mol/L H2O2 H2O
当v = ─V─2m时， Km = [S]
3
2. 汉斯方程
2. 汉斯方程
在实际应用中，通过动力学曲线求Km值，即使用很大
的[S]，以也不只同能的得底到物趋浓近度于[SV]为m的横反坐应标速，度[S，]/v难为以纵达坐到标真，正将 的各Vm点a连x，成因一此直测线不，到并准向确的纵K轴m方值向。为延得长到，准此确延的长K线m值在，横 可 法轴以求上把出的米Km截氏值距方。即程本为转实–化K验m为采值y用。= 汉ax斯+ b作的图直法线(H方an程es，P然lo后t)求用K图m值解。
通过汉斯作图法可求出过氧化氢酶的Km值和Vm值。
说明：
① KMnO4既是氧化剂，又是指示剂； ② Mn2+是滴定反应的催化剂。
5
操作 1. 肝匀浆制备