10 过氧化氢酶米氏常数的测定

12
*Excel双倒数作图
Excel 双倒数作图
(–1/Km＝–0.04,0)
-0.1
-0.05
9 1/v (10min/mmol)
8 7 6 5 4 3 2 (0,1/Vm＝1.83) 1
0
0.05
y = 45.786x + 1.8311
Km = 25 mmol/L Vm = 0.546 mmol/10min
本实验以鼠肝匀浆中的过氧化氢酶为例，测定其 Km值和Vm值。
过氧化氢酶
2H2O2
2H2O + O2
2KMnO4 + 5H2O2 + 3H2SO4
2MnSO4 + K2SO4 + 5O2↑ + 8H2O
过氧化氢酶催化H2O2分解成H2O和O2； 反应后剩余的H2O2用KMnO4在酸性溶液中滴定；
通过滴定KMnO4的消耗量求出反应前后H2O2的浓度差 即为反应速度v；
试剂 (ml)
0.04mol/L H2O2 H2O
肝匀浆液1:500
10％H2SO4
记录0.02mol/L KMnO4用量 底物浓度[S] (mmol/L) 反应速度v (mmol/10min) [S]/v (10min/L)
1号瓶 2号瓶 3号瓶 4号瓶 5号瓶
25
20
15
10
5
0
5
10
15
20
放入37℃水浴5分钟
过氧化氢酶米氏常数的测定
河南科技大学医学院 生物化学与分子生物学教研室
【目的】
【目的】
1. 掌握米氏方程及其意义。 2. 掌握过氧化氢酶米氏常数测定的原理、方
法和步骤。
2
【原理】 1. 米氏方程
【原理】
1. 米氏方程：当环境温度、pH、酶浓度等条件恒定时，酶
促反应速度v 与底物浓度[S]的关系符合米氏方程。
0.01
0.015
0.0218 0.025
0.02 v/[S] (L/10min)
14
*Excel直线作图
Excel 直线作图
直接从坐标点读出：
Km = 25 mmol/L Vm = 0.545 mmol/10min
0.6 v (mmol/10min)
0.5 0.4 0.3
(25, 0.545)
0.2
肝匀浆液1:500
10％H2SO4
记录0.02mol/L KMnO4用量 底物浓度[S] (mmol/L) 反应速度v (mmol/10min) [S]/v (10min/L)
1号瓶 2号瓶 3号瓶 4号瓶 5号瓶
25
20
15
10
5
0
5
10
15
20
放入37℃水浴5分钟
1
1
1
1
1
分别加入，准确记时10分钟
y = 1.8277x + 45.854
140 [S]/v (10min/L)
120 100
Km = 25 mmol/L Vm = 0.543 mmol/10min
80
60
40
—Km–
Vm
=
46
20 –Km = –25
-35 -30 -25 -20 -15 -10 -5 0
[S] (mmol/L) 5 10 15 20 25 30 35 40 45
当v = ─V─2m时， Km = [S]
3
2. 汉斯方程
2. 汉斯方程
在实际应用中，通过动力学曲线求Km值，即使用很大
的[S]，以也不只同能的得底到物趋浓近度于[SV]为m的横反坐应标速，度[S，]/v难为以纵达坐到标真，正将 的各Vm点a连x，成因一此直测线不，到并准向确的纵K轴m方值向。为延得长到，准此确延的长K线m值在，横 可 法轴以求上把出的米Km截氏值距方。即程本为转实–化K验m为采值y用。= 汉ax斯+ b作的图直法线(H方an程es，P然lo后t)求用K图m值解。
1
1
1
1
1
分别加入，准确记时10分钟
5
5
5
5
5
0.02mol/L KMnO4滴定
13.38 9.96 6.77 3.84 1.43
38.462 30.769 20.377 15.385 7.692
0.331 0.302 0.262 0.208 0.129
9
③ 计算各管[S]/v
3. 计算
③ 计算各管[S]/v值(10min/L)填入下表
5
5
5
5
5
0.02mol/L KMnO4滴定
13.38 9.96 6.77 3.84 1.43
38.462 30.769 20.377 15.385 7.692
8
3. 计算
② 计算各管反应速度
② 按下式计算各管反应速度(mmol/10min)填入下表
(mmol/L) = H2O2浓度(mmol/L) × 加入H2O2的体积(L) – KMnO4(mmol/L)× 消耗的KMnO4的体积(L)× 5/2
10
3. 计算 ④ 汉斯方程作图求Km值和Vm值
④ 汉斯作图
汉斯方程： —[Sv]–
=
—Km– Vm
+
—1– Vm
•
[S]
以[S]为横坐标，[S]/v 为纵坐标，制作[S]/v ~[S]坐标图。将测定各点连成一直
线，并向纵轴方向延长与横轴相交，交点为横截距，即–Km 。纵截距为Km / Vm 。
从坐标图查得 –Km = –25，即：Km = 25 mmol/L 。 从坐标图查得 Km / Vm = 46，将Km值代入求得：Vm = 0.543 mmol/10min 。
0.1 [S] (mmol/L)
-40 -35 -30 -25 -20 -15 -10 -5 0 5 10 15 20 25 30 35 40
15
结果分析讨论
【结果分析讨论】
16Fra Baidu bibliotek
再见
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试剂 (ml)
0.04mol/L H2O2 H2O
肝匀浆液1:500
10％H2SO4
记录0.02mol/L KMnO4用量 底物浓度[S] (mmol/L) 反应速度v (mmol/10min) [S]/v (10min/L)
1号瓶 2号瓶 3号瓶 4号瓶 5号瓶
25
20
15
10
5
0
5
10
15
20
放入37℃水浴5分钟
③ 取1:10的匀浆液1ml，用pH7.0的磷酸缓冲液稀释 定容至50ml(1:500)。
6
2. 反应速度测定
2. 反应速度测定
取干燥的100ml锥形瓶5只，编号，按下表操作。
试剂 (ml)
0.04mol/L H2O2 H2O
肝匀浆液1:500
10％H2SO4
记录0.02mol/L KMnO4用量
1
1
1
1
1
分别加入，准确记时10分钟
5
5
5
5
5
0.02mol/L KMnO4滴定
13.38 9.96 6.77 3.84 1.43
38.462 30.769 20.377 15.385 7.692
0.331 0.302 0.262 0.208 0.129
116.198 101.885 88.248 73.964 59.862
[S]/v (10min/L) 120
y = 1.8277x + 45.854 100
80
60
40
—Km–
Vm
=
46
20
–Km = –25
[S] (mmol/L)
–30 –25 –20 –15 –10 –5 0 5 10 15 20 25 30 35 40
汉氏作图
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*Excel汉斯作图
Excel 汉氏作图
将米氏方程两边取倒数再乘以[S]即为汉斯方程：
v
Vmax[S] =K─m─+─[S─]
方程式两 边取倒数 再乘以[S]
[S]
──v =
──1Vm. [S]
+
──
Km Vm
(汉斯方程式)
[S]
──v
斜率
=
1 ─V─m
K─Vm─m
–Km
0
汉斯方程作图
[S]
4
3. 鼠肝过氧化氢酶测定化学反应原理
3. 鼠肝过氧化氢酶测定化学反应原理
1/[S] (L/mmol)
0.1
0.15
0.2
13
*Excel-Eadie-Hofstee作图
Excel-Eadie-Hofstee 作图
-0.005
0.6 v (mmol/10min)
0.545 0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
0.005
y = -25.051x + 0.5467
Km = 25 mmol/L Vm = 0.545 mmol/10min
1号瓶 2号瓶 3号瓶 4号瓶 5号瓶
25
20
15
10
5
0
5
10
15
20
放入37℃水浴5分钟
1
1
1
1
1
分别加入，准确记时10分钟
5
5
5
5
5
0.02mol/L KMnO4滴定
13.38 9.96 6.77 3.84 1.43
说明：① 试剂加量要准确；
② 每个三角瓶可分别保温，但要准确计时。
③ 10％H2SO4液可事先准备好，到时直接倾入。
v
Vmax[S] =K─m─+─[S─]
Vmax：最大反应速度 Km：米氏常数
初速率 v
80 Vm
60
Vm 40 2
动力学曲线
20
K
m
0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
底物浓度 [S]
Km值：可通过对米氏方 程 作 图 (V~[S] 图 ) 求 出 。 在数值上等于酶促反应 速度为最大速度一半时 的底物浓度值。单位是 mol/L(或mmol/L)。
通过汉斯作图法可求出过氧化氢酶的Km值和Vm值。
说明：
① KMnO4既是氧化剂，又是指示剂； ② Mn2+是滴定反应的催化剂。
5
操作 1. 肝匀浆制备
【操作】
1. 肝匀浆制备
① 将小白鼠处死，立即取出肝脏，去除胆囊及结缔 组织，用0.45％的盐水洗净。
② 称取1g肝组织加1ml 0.45%盐水放入匀浆器，研磨 成匀浆。取上述匀浆，用pH7.0的磷酸缓冲液稀 释至1:10。
④ KMnO4用量记录精确度：0.01
7
3. 计算
3. 计算 ① 计算各管底物浓度
① 按下式计算各管底物浓度(mmol/L)填入下表
[S] (mmol/L) =
H2O2 浓度(mmol/L) × 加入H2O2的体积(ml) 26ml(反应液总体积)
试剂 (ml)
0.04mol/L H2O2 H2O