体细胞核移植技术进展

基金项目:国家自然科学基金资助项目(30270490),重庆市科技计划项目(7452)

作者单位:400037 重庆,第三军医大学新桥医院神经内科[周竹娟 郑 健(通讯作者)]

体细胞核移植技术进展

周竹娟(综述) 郑 健(审校)

中图分类号 Q 23 文献标识码 A 文章编号 1007-0478(2008)04-0251-03

转基因动物的研究和生产是动物胚胎工程中最诱人和

最有发展前景的课题之一。早期用受精卵原核内注射外源基因和利用精子作为载体将外源基因导入受精卵的方法,其缺点是整合效率低,而且很难实现定点整合,出生的转基因动物外源性基因的表达也不稳定[1]。著名的多丽羊的诞生使体细胞核移植技术成为一种新的生产转基因动物的方法。核移植(nuclear transfer,N T )通常是指将外源性细胞核作为供体转入到去核卵母细胞中,细胞核发生基因程序重编获得多能性,开始新的胚胎发育。细胞核移植能更为有效地对动物基因进行修改,是唯一可以用来生产大量相同基因型动物的方法[2,3]。1997年前核移植的供体核主要来源于胚胎细胞,多丽羊的诞生表明成年体细胞核也可以作为核移植的供体核。近年的研究将基因修饰与核移植技术相结合,通过质粒转染的方法将某基因整合到细胞核中,再将此类细胞筛选出来,把这些细胞核转入到去核卵母细胞中,建立重组胚,产生的胚胎中所有的细胞均携带这种基因,使其生物技术应用价值得到进一步提高[4]。应用核移植技术比原核内注射更能有效转入和结合更大的(>100kb)DN A 片断,也有利于强化有利的等位基因和/或去除不利的等位基因[4]。

1 细胞去核的方法

在核移植技术中细胞去核的方法有三种。一是用机械方法去核。常见机械去核方法有用显微操作仪将核吸出[5~7]或是用梯度离心的方法将细胞核和胞质体分开[8]。近年又发展了改良的微操作法去核,且对去除透明带的卵母细胞进行微操作法去核较不去除透明带的传统微操作法去核成功率更高[7];二是用X 线照射的方法去核[9]。有研究比较用显微操作仪去核的机械方法和用X 线照射的方法去核,重组胚发育到两细胞阶段、八细胞阶段、胚泡阶段的比例没有明显差异,但X 线照射可能产生其它意想不到的副作用,如减少了重组胚的发育潜能,可能与X 线去核引起D NA 诱变有关。因此,尚需大规模实验来证实X 线去核法的安全性[9];三是应用秋水仙胺的化学方法去核。有研究显示化学方法去核作用的起始时间和持续时间长短对去核率有很大影响,去核效率从3.4%~91.7%不等,用这种方法产生的

去核卵母细胞可成功用于核移植[10~12]。现也有研究将化学方法和机械方法去核相结合,用秋水仙胺处理卵母细胞,再去除卵丘细胞、消化部分透明带,用显微刀片对形成单极体的卵母细胞进行定向切开,从而获得胞质体;其去核效率较单用显微刀片机械去核效率高[13]。2 核移植的方法

目前用于细胞转核的方法有以下几种:(1)电融合法;(2)PEG 介导法;(3)微注射法。

2.1 电融合法 电诱导细胞融合是20世纪80年代发展起来的一项细胞工程技术。它是使细胞在电场中极化成偶极子,并沿电力线排列成串,然后用高强度、短时程的电脉冲击穿细胞膜而导致细胞融合。该方法具有融合过程容易控制、融合效率高、无毒性、可重复性强、作用机制相对比较清楚等

优点[14]

。进行电融合时融合槽中细胞悬液的细胞密度通常为105/ml,电介质电泳的交流电场振幅为10~30V /mm,频率为1~3M H z,在80%以上细胞形成串珠时加用10~50 s 的100~1000V/mm 的直流高压使细胞发生融合[15]。

电融合的参数如电融合的时间、脉冲强度、融合介质的平衡,都与胞质体和核来源细胞的物种有很大的相关性[4]。核供体细胞来源相同时,电融合参数相近。细胞融合效率随物种和细胞类型不同而不同[16,17]。N agashima 等采用10 s 的200V/mm 的高压直流脉冲使猪胚胎成纤维细胞核与猪成熟去核卵母细胞胞质体中发生融合[2]。Shin 等采用15 s 的175~185V/mm 的高压直流脉冲作为将成年牛耳成纤维细胞细胞核转入牛去核卵母细胞胞质体中的电融合条件[6]。Das 等的研究显示将山羊胚胎成纤维细胞细胞核转入山羊去核卵母细胞胞质体中,给予20 s 的250V /mm 、300V/mm 和350V /mm 的直流脉冲可分别有7.7%、18.8%和33.3%的重组胚胎形成单侧切迹,10.2%、18.8%和16.7%的重组胚胎形成双侧切迹;给予5 s 的250V/mm 、300V/mm 和350V /mm 的直流脉冲可分别有12.5%、17.1%和8.3%的重组胚胎形成单侧切迹,25%、20%和16.7%的重组胚胎形成双侧切迹;给予10 s 的250V /mm 的直流脉冲有4.8%的重组胚发育到两细胞阶段;给予5 s 的300V/mm 的直流脉冲有8.3%的重组胚发育到两细胞阶段;给予10 s 的300V /mm 的直流脉冲有6.3%的重组胚胎发育到两细胞阶段。从山羊胚胎成纤维细胞核与山羊去核卵母细胞胞质

体融合后重组胚的形成和发育情况来看,用300V /mm 的直流脉冲进行融合较为理想[5]。

融合后需对重组胚进行激活,成功的激活能促进胚泡的发育,胚泡发育至一定阶段后才能植入合适的受体动物体

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内[4]。尽管电融合在转核的同时可以使重组胚胎发育激活,但应用更普遍的是采用离子载体和蛋白激酶抑制剂结合的化学激活方法[2,3]。电融合后用蛋白酶抑制剂M G132处理重组胚可明显增加重组胚的发育潜能,胚泡形成率较对照组明显增加[18]。有研究表明将成年牛耳成纤维细胞植入去核卵母细胞的卵黄周,然后进行电融合和化学激活;在电融合后4h,对重组胚进行化学激活,重组胚发育到胚泡和两细胞胚胎的比例比同时进行电融合和电激活或同时进行电融合和化学激活比例要高,这可能与电融合和后续的化学激活导致受体卵母细胞胞浆环境改变,有利于重组胚进行基因程序重排有关[6]。M elican的研究显示将羊胚胎细胞核转入去核卵母细胞时,同时进行电融合和激活与电融合后再进行电激活相比,所得到重组胚的形成率和重组胚的卵裂率无明显差别[16]。

电融合可以一次性处理大量的细胞。近年来发展起来的将微观流体和电融合技术相结合的方法,甚至可以同时进行多种细胞的融合,并对融合细胞进行分选,可以快速、有效地获得融合细胞的组合库[15]。电融合唯一的缺点是需要有昂贵的特定的设备来完成。

2.2 聚乙二醇介导的细胞融合法 聚乙二醇(polyethylene glycol,P EG)介导的细胞融合是一种简单有效的方法。它广泛用于生产体细胞杂交体和进行体细胞核移植,生产体细胞杂交体时将两种细胞悬液混合后离心沉淀,再将聚乙二醇加入到细胞团中诱导两种细胞发生融合[14]。PEG介导的细胞融合可以在贴壁细胞之间、悬浮细胞之间、贴壁细胞和悬浮细胞之间进行,可以用整个细胞或含核微小细胞作为供体与受体细胞发生融合[19]。

PEG介导细胞融合的机制不清。目前普遍认为PEG 能改变各类细胞的膜结构,使两细胞接触处质膜的脂类分子发生疏散和重组,由于两细胞接口处双分子层质膜的相互亲和以及彼此的表面张力作用,使细胞发生融合[14]。

PEG介导的细胞融合法现多用于两种细胞的融合。采用PEG的分子量由1000~6000不等,浓度多在50%左右,作用时间在50s至2~3min不等,可能与融合的细胞种类不同有关。因PEG本身具有毒性,延长作用时间可能会导致细胞死亡增加[20]。

将PEG用于细胞转核实验的报道较少。Do等成功应用PEG介导胚胎干细胞细胞核与神经干细胞融合,使神经干细胞中本来静止的O ct4基因出现表达[8]。

为提高转核效率,有学者将电融合技术与PEG介导法相结合,在将乳腺上皮细胞的核转入去核卵母细胞前,先用pH8.0的PEG/二甲亚砜(dimethy l sulphox ide,DM SO)对乳腺上皮细胞处理5min再进行电融合,转核效率可明显提高,且不会影响重组胚的发育[21]。

PEG诱导细胞融合的优点在于经济、操作简单易行、可一次对较大数量细胞进行操作,实验周期短,但PEG介导的细胞融合很难标准化。细胞团的大小、形状,P EG加入细胞团后振摇的速度,加入PEG到除去PEG的时间间隔都可能影响实验结果。

2.3 显微注射法 借助显微操作仪将供体细胞核从供体细胞中分离出来,直接注射到去核卵母细胞的胞浆中,然后再用伊屋诺霉素和6-二甲基氨基嘌呤或6-4-二甲基氨基吡啶或亚胺环己酮对重组胚进行激活[22~24]。

比较电融合和传统微注射两种核移植方法,可以发现两种方法构建的重组胚胎发育情况有一定的差异。Nag ashima 等研究发现电融合组正常卵裂速度和胚泡形成的速度明显高于微注射组(45.6%:32.1%,19.2%:5.4%,P<0.05),且电融合方法建立的重组胚可以发育成正常的无性生殖胚胎,而注射法建立的重组胚不能发育成正常的无性生殖胚胎[2]。L achamn-K aplan等分别用微注射和电融合的方法将胚胎成纤维细胞核转入牛去核卵母细胞中去,前者有8%~16%的重组胚发育到胚泡阶段,但没有活的动物出生,而后者有22%的重组胚发育到胚泡阶段,有两只健康的小母牛出生[25]。可见从重组胚的发育上来说,电融合方法优于传统的微注射法。

核移植和卵母细胞活化时间的协调是核移植成功的关键,因此近年出现改良的一步微注射法。该方法在卵母细胞活化前(通常卵母细胞在离开输卵管60m in后会自动活化)将外源性有丝分裂细胞核注射到未激活的卵母细胞中,再用微操作仪去除减数分裂中期的卵母细胞核[26]。Zho u等[27]比较了电融合法和一步微操作法,发现一步微操作法获得的重组胚发育到囊胚的比例比电融合法高,且囊胚的发育更为正常。可见传统的微注射法可能因卵母细胞去核和核供体细胞去核分开进行,步骤多,时间长,核移植时卵母细胞已经活化,影响了核移植的成功率。根据重组胚发育情况,不同核供体细胞优先选择的转核方法各不相同。羊膜上皮细胞作为核供体细胞时用电融合方法建立的重组胚发育情况较好,而用胚胎成纤维细胞作核供体细胞时用一步微注射方法建立的重组胚发育情况更好[28]。

总之电融合和显微注射法各有利有弊。电融合方法应用广泛,可靠性高,在转核的同时可以激活卵母细胞,供体细胞膜的状态会影响转核效率。显微注射法技术难度大,不能同时激活受体卵母细胞,但其操作步骤较少,转核效率与供体细胞膜的状态无关[2]。另外显微注射法每次处理细胞量也少于电融合法。

近年来为减少核移植时对细胞的破坏,又发展起来一种振动微注射的方法,也称压电微注射。该方法是将微量吸管固定到共振频率为70kH z的压电陶瓷上,微量吸管在振动时就可很容易进入细胞中,而对细胞没有急速的抑制作用。用压电微注射的方法将供体细胞核转入去核卵母细胞中,重组胚的生成率比电融合方法高,但压电微注射可能引起DN A的破坏和细胞凋亡[29],重组胚发育到胚泡阶段的比例低于电融合组。两种方法建立的胚胎植入受体动物后受孕率相当,与供体细胞来源、融合方法、激活方法无关[23,30]。

3 核移植技术的应用

核移植技术有广阔的发展前景。它将外源细胞核作为基因的供体,可用于生产转基因动物,用于提高牲畜品质,如提高牛奶产量或羊毛质量,挽救濒危动物,生产药物,生产适

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Stroke and N er vous Diseases,Aug2008,V ol.15,No.4