第2节 酶在工业生产中的应用

酶工程的资料

一、酶工程内容：

（一）“产酶”模块，包括微生物发酵产酶、细胞工程产酶和现代分子技术产酶等；

（二）“分离酶”模块，包括酶的酶学性质、酶的分离纯化等；

（三）“改造酶”模块，包括酶的分子修饰、酶的固定化和酶的有机催化等；

（四）“用酶”模块，包括酶在医药、食品、轻化工、环境保护和生物技术等方面的应用。

二、酶的基因工程与蛋白质工程

酶是具有催化功能的蛋白质，其催化的多样性已使其在生物产业中得到广泛应用。应用自然界酶分子进化原理，构建具有实际应用所需的高催化效率、高稳定性的酶是蛋白质工程研究的重要目标。随着人们对酶的三级结构了解的增加，越来越多的合理设计方法，比如定点突变和结构域重组，被用来改变酶的性质和功能。通过合理设计改造的酶，不仅在工业和医药等方面起着重要作用，也加深了人们对于蛋白质结构-功能关系的认识。结构域重组是自然界中蛋白质进化的一个重要途径，也是人工设计和改造酶蛋白的有效策略。天然存在的与多种功能和性质相关的蛋白质结构域为人们构建新型酶蛋白提供了重组素材。传统的结构域重组方法通过重组同源蛋白质的结构域，已经成功地构建出了许多嵌合酶。它们或具有新的催化活力，或改变了底物特异性，或在稳定性上获得了提高，等等。一般来讲，重组亲本的同源性越低，嵌合酶获得新功能的可能性越大。重组低同源性的亲本蛋白质的困难在于，来源于不同亲本的结构域在重组过程中往往会破坏结构域界面上的相互作用，导致无活力的嵌合酶。因此，蛋白质工程的合理设计需要加深对蛋白质进化机制的理解，以及有效地构建嵌合蛋白质的新策略。

蛋白质的合理设计是最早出现的蛋白质工程方法，它发展迅速并有着广泛的应用。合理设计是在对蛋白质结构-功能关系的认识的基础上，通过定点突变等技术对蛋白质的性质和功能进行改造的一种方法。应用合理设计改造蛋白质依赖于对蛋白质三级结构的了解。随着计算生物学的发展，即使目标蛋白质并没有获得解析的晶体结构，人们也可以通过与其同源的蛋白质结构进行计算机同源建模，获得其可能的结构。理论与实验相结合的特性使得合理设计成为研究蛋白质结构-功能关系的强有力的途径。根据设计所涉及的范围，合理设计可以分为如下几类：

1 定点突变（site-directed mutation）

定点突变是指通过聚合酶链式反应（PCR）等技术向目的 DNA 片段中引入所需变化，包括碱基的添加、删除、点突变等[5]。定点突变能迅速、高效地提高 DNA 所表达的目的蛋白的性质。

根据已知的蛋白质三级结构信息以及对其性质的了解，可以推测出特定氨基酸残基在蛋白质结构中的作用，而生物信息学的发展也为预测特定氨基酸残基的功能提供了新的手段。综合利用这些信息，对具有重要功能的氨基酸残基进行定点突变可以有效地改变蛋白质的性质。

定点突变与随机突变组合应用也是改善酶的性质的有效途径。漆酶由于其宽的底物谱和催化反应类型在工业上具有重要的应用价值，但是却受到它们低表达量和催化活力的限制。oschorreck 等人通过随机突变和定点突变方法的结合，使该酶的表达量提高了 11 倍，其催化酚酸聚合的活力也比野生型得到明显提高

2、蛋白质的结构域重组（domain recombination）

定点突变只集中在对蛋白质分子的小范围改造，大多数情况下不能得到功能上的跃迁。随着对蛋白质折叠和蛋白质结构认识的深入，人们发现一些天然存在的蛋白质虽然具有相似的折叠，但在一级序列和功能上却有着很大的差别。随着对酶结构与功能研究的深入，人们逐渐认识到，酶的作用机制具有模块化性质。将与酶热稳定性或底物特异性相关的基本模块如二级结构元件、亚结构域、结构域进行重组构建嵌合蛋白质，一方面可以用来研究蛋白质序列和功能之间的关系，另一方面也可以得到大量新的蛋白质。

传统的结构域重组方法是在结构域之间的柔性连接区（loop）将来源于不同亲本的结构域连接起来。人们利用这种结构域重组方法已经成功地改造了一些酶的性质。例如 Griswold 等人重组了来源于人和鼠的 GST 蛋白的结构域，得到的嵌合酶获得了催化谷胱甘肽转化成利尿酸的活性，这种活性在亲本蛋白质中是不存在的。一般来讲，重组亲本的亲缘关系越远，获得的杂合蛋白质的性质发生改变的可能性越大，但同时也会带来更多的残基之间的冲突。事实上，当亲本的一级序列一致性小于 70%，利用传统的结构域重组得到的杂合蛋白质往往会产生错误的折叠。这就是低同源蛋白质结构域重组带来的交叉破坏。人们希望打破这一限制，因为同源性越低的蛋白质之间进行结构域重组产生具有新功能的杂合蛋白质的可能性越高。

3、全新的蛋白质分子设计也叫从头设计。它是从一级序列出发，设计一个特定的蛋白质序列，使其折叠成一个复杂的，有功能的蛋白质以满足人们的各种需要。蛋白质的功能与它的三级结构密切相关，通过序列的改变可以实现结构的改变从而获得功能的多样性。从头设计自然界不存在的蛋白质是蛋白质工程中的一个重大挑战。近年来，复杂的计算机算法的迅速发展，使这一领域取得了很大的进展。

固定化酶（Immobilized enzyme）：用物理或化学手段将游离的酶封锁在固体材料或限制在一定区域内进行的活跃的，特有的催化技术，并可回收长时间使用的一种技术。固定在一定载体上，在一定空间范围内起催化作用的酶。

1交联法：

借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作用，制成网状结构的固定化酶。

2包埋法：

将酶和细胞包埋于各种高分子聚合物制成的多孔载体【小球】内，制成固定化酶。

3、吸附法：

利用各种固体吸附剂【活性炭、多孔陶瓷等】将酶吸附在包面，使酶固定的方法。

优点：

固定化酶可以重复，使用效率高，成本低

极易将固定化酶与底物、产物分开；简化了提纯工艺；

2001年世界酶制剂年销售额达16亿美元，我国各种工业酶制剂总产量超过32万吨，产值6亿多元，应用覆盖洗涤剂、纺织、酒精、白酒、啤酒、味精、有机酸、淀粉糖、制药、制革、饲料、造纸、果汁、肉、蛋、豆、奶、面制品加工等诸多工业领域，创造工业附加值数千亿元。

据中国发酵工业协会最新统计，我国2001年酶制剂生产量为32万吨。已实现工业化生产的酶种有20多种。产品以糖化酶、α－淀粉酶、蛋白酶等三大类为主，此外还有果胶酶、β－葡聚糖酶、纤维素酶、碱性脂肪酶、木聚糖酶、α－乙酰乳酸脱羧酶、植酸酶等。主要产品的生产水平达到国外90年代初国际先进水平。我国酶制剂产品主要应用于酿酒、淀粉糖、洗涤剂、纺织、皮革、饲料等行业，对这些行业改革工艺、提高质量、降低消耗、提高得率、减轻劳动强度、改善环境起到积极作用。

我国酶制剂的主要应用领域是食品工业，全世界食品工业用酶约占总量的60％，我国更高达85％以上。

果胶酶的综合：