实验三、鸡胚细胞的原代培养(改进)

13. 分别取2ml ,2ml和3ml细胞悬液接种至三只培 养瓶中(3ml在塑料瓶),补加培养液至总体积 5ml; 14. 培养瓶加塞, 侧面标记。 37 ℃培养. 15. 后天上午来观察细胞,并进行细胞传代. 生长面
含鸡胚鸡蛋示意图
标记气室示意图
培养中的成纤维细胞
注 意
清理台面,用品洗净,交回. 预习下节课内容：细胞的传代培养/冻存 一个总的实验报告,包括上周实验准备工作, 本周的原代培养和传代培养. 要对结果进 行分析。
• B分散细胞培养 目的——反映了单个细胞的生物学特性 ——对单一细胞类型进行分离和纯化 接种方法： 1. 用吸管吸取一定量的细胞悬液，加入培养 器皿中，加入适量的培养液，封口 2. 恒温培养 3. 观察细胞生长状态，及时更换培养液。
• C悬浮细胞培养 某些白血病细胞、腹水瘤细胞等。 对培养基不断搅拌或者对培养器皿进行 振荡、旋转而维持细胞的悬浮状态。
鉴定各种细胞产物的程序。
无血清培养液中补加物具有独特性：适用于某 种细胞株的培养液，很可能不适合另一种细胞 株的生长。即使同源组织的不同细胞株，所需 补加物也不同。 无血清培养基的目前使用情况：尚处于研究阶 段，难以推广。目前，绝大多数人工合成培养 基使用时还需添加血清
抗 菌 素 的 使 用
抗生素的作用：在培养液配制后，培养液内常加 适量抗菌素，以抑制可能存在的细菌的生长。 抗生素的使用量：通常是青霉素和链霉素联合使 用。培养基内青霉素、链霉素最终使用浓度为每 毫升100单位。 庆大霉素：每毫升100单位——方便、广谱、稳 定
6. 将材料转入B再次清洗; 7. A换Hank’s，材料再于A中漂洗; 8. 剪取1/5~1/3的组织,转入小烧杯(10ml) ，剪成 0.5~1mm3碎块。 9. 将碎块倒入三角锥瓶,用1ml胰酶清洗小烧杯, 合入锥瓶,迅速摇匀; 10. 锥瓶加塞,覆口,拿出工作台,于37 ℃水浴锅中 消化5~7分钟(严格)!,中间摇动2~3次; 11. 于超净工作台中加入4~5ml培养基,终止消化. 用吸管充分吹打7~8次; 12. 将细胞悬液用纱布过滤,进入20ml烧杯(凹面!) 用培养基清洗纱布2次,每次3~4ml;
细胞培养的优点
1.便于应用物理、化学、生物等外界 因素探索和揭示细胞生命活动的规 律； 2.便于应用各种不同技术方法研究和 观察细胞结构和功能的变化； 3.可以长期研究和观察细胞遗传行为 的改变； 4.可以提供大量生物性状相同的细胞 作为研究对象。
提 纲
1.关于原代培养的概念 2.培养基的类型及配制 3.原代培养的过程 4.原代培养的注意事项 5.本次实验操作要点 6 .实践操作.
原代培养的注意事项
• 1.培养液 按照细胞生长情况，选择最适合的培养液； 摸索需要补加的成分及添加量； 培养体系的酸碱度； 适当换液。 • 2.培养空间 培养液体与液体上方的空间的体积比为 1:10为宜。液体的高度最好维持在 2-5mm；
本次实验内容
用品器材
1.超净工作台内： 污物缸1个、酒精灯2个、 酒精棉球1瓶、大镊子1把、打火机1个、 5毫升移液器, 1640培养基30毫升(方瓶，2人共用） 、 Hank’s液20毫升（圆瓶，2人共用）； 2.饭盒1个,枪头4支,
实验三、 实验三、 鸡胚细胞的原代培养
为什么要进行细胞培养
高等生物是由多细胞构成的整体，在整体 条件下要研究单个细胞或某一群细胞在 体内（in vivo）的功能活动是十分困难的。 如果把活细胞拿到体外（in vitro）培养进 行观察和研究，则要方便得多。 高等动植物细胞要求的生存条件极其严格， 稍有不适就要死亡。所以细胞培养技术 （cell culture）就是选用最佳生存条件对 活细胞进行培养和研究的技术将组织切割成一定大小的 植块，接种到培养器皿中，加入 培养液进行培养。 目的：——观察植块的组织学生长行为， 使植块细胞迁移并在植块外分裂增 殖，取出植块后得到细胞培养物。
植块培养接种方法
1.用湿润的吸管将植块小心吸取并轻轻吹 出到培养瓶中，按照一定的形式或者间 隔将植块排列好； 2.加入培养基，倒转培养一天； 3.待植块贴壁后，再倒转培养瓶，使植块 浸没在培养液中，继续培养； 4.观察细胞生长情况，按照生长情况更换 培养液。
原代培养的概念
原代培养 （primary culture）：从动物机体 取出的进行培养的细胞群。原代培养的 细胞生长比较缓慢，而且繁殖一定的代 数后（一般10代以内）停止生长，需要 重新更换培养基。将细胞从一个培养瓶 转移到另外一个培养瓶即称为传代或传 代培养（Passage）。
培养方式
• 组织培养 • 细胞培养 • 器官培养
培 养 基
培养基（培养液）是维持体外细胞生存和生 长的溶液，分天然培养基和合成培养基。 天然培养基： （一）天然培养基： 类型：有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚 和牛胚浸液）。 优点：营养成分丰富，培养效果好 缺点：1.来源受限。 2.成分复杂，影响对某些实验产物的提 取和实验结果的分析。 3.易发生支原体污染
完全培养基的组成
• • • • 基础培养基 血清 碳酸氢钠 青、链霉素 80％一95％ 5％一20％ 2.0 g/L 各100单位／毫升
培养基的配制
RPMI-1640培养粉 碳酸氢钠 青、链霉素 1袋 2.0 g 各100单位/毫升
加三蒸水 至 1000ml, 过滤除菌。调节 pH值至7.2，加血清至终浓度为 10％。
操
1. 2. 3. 4. 5.
作
照egg,画气室线. egg消毒,台面消毒; 戴无菌袖套.点燃酒精灯，手部消毒。 将egg置于蛋座（气室朝上），外表再次消毒。 中镊敲碎蛋壳，沿气室线剥开。 Hank’s液→培养皿A，B。(大镊子夹瓶塞，用 吸管吸取) 6. 小镊撕内膜，挑出鸡胚→ A清洗,剪去头,肝, 腿,翅等。
无血清培养基
1975年，Sato首次成功地无血清培养基培养了垂体 细胞株，近20多年来已报道用了几十种细胞系在无血清 培养基中成功地生长和增殖。 应用领域：在生长因子、蛋白质工程、基因表达调控等 研究领域，迫切需要用无血清培养基培养细胞。 主要研制策略：在基础培养基中补充各种必需因子，如 激素、生长因子 、结合蛋白 、贴壁和扩展因子 等。 配制：无血清培养基由基础培养基和替代血清的补充成 分组成。 优点：无血清细胞培养基的使用保证了实验结果的准确 性、可重复性和稳定性，减少了细胞污染，简化了提纯和
利用血球计数板在显微镜下直接计数，是一 种常用的细胞计数方法。此法的优点是直观、 快速。将经过适当稀释的细胞悬液放在血球计 数板载玻片与盖玻片之间的计数室中，在显微 镜下进行计数。由于计数室的容积是一定的， 所以可以根据在显微镜下观察到的细胞数目来 换算成单位体积内细胞总数目。
取材注意事项
1. 取材要准确； 2. 因“材”制宜进行处理； 3. 保持湿润； 4. 使用锋利的刀剪，防止细胞损伤。 5. 动作快，耗时越少越好，可以使用 低温（4℃）。
C. 加入蛋白酶消化液，密封于37℃消化 ； D. 消化结束后，吸去含酶溶液，加入蛋白 酶抑制剂或者含有血清的培养基，终止 蛋白酶的活性； E. 用吸管吹打消化液，使单个细胞游离； F. 过滤离心收集单个细胞，以少量的培养 液重新悬浮细胞； G. 用计数板计算细胞密度，调节细胞密度， 接种。
血球计数板计数法原理
（二）合 成 培 养 基
概念：是根据细胞生存所需物质的种类和数量，用 人工方法模拟合成的。目前使用的合成培养基有 TC199、MEM、RPMI-1640、 DMEM等。 主要成分: 氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和 其它一些辅助物质。 优点: 标准化生产，组分和含量相对固定，成本低 。 缺点: 缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需 要；人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细 胞生长和繁殖，还需补充一定量的天然培养基(如血 清)。
原代培养的过程
取材——培养材料的制备 ——接种——加培养液— 培养
1.取材 取材
1）准备工作： A. 解剖取材器具、用品的清洗、包装、 灭菌 B. 工作台面、工作环境的消毒 C. 操作者本人的消毒：肥皂水刷手， 0.2%新洁尔灭浸泡前臂或者用酒精擦 拭消毒，穿工作衣，戴帽、口罩 D.对实验动物消毒
血清的成分
血清中的成分复杂，至今尚未完全清楚。主要有 以下成分： ①多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等）； ②多种金属离子；③激素；④促贴附物质，如纤 粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等；⑤各种生长因子； ⑥转移蛋白；⑦不明成分。 血清中不仅存在促细胞生长因子，同时也存在细 胞生长抑制因子或毒性因子，因此在含血清培养 基中培养的细胞所反映的生物学特性是细胞和复 杂血清因子的综合反应。
合成培养基中血清的加入量：一般说来．含5％小 牛血清的培养基对大多数细胞可以维持细胞不 死．但支持细胞生长一般需加 10％血清。 血清质量好坏是实验成败的关键。 常用血清类型：有胎牛血清、新生牛血清、小牛血 清、兔血清、马血清等，其中以胎牛血清质量最好。 优质血清的标准：透明，淡黄色，无沉淀物，无细 菌、支原体、病毒污染。 血清的灭活（消除补体活性）：56 ℃ ，30 分钟。 血清的消毒：过滤除菌。
2.取材和培养材料的制备 取材和培养材料的制备
• A.切取合适大小的组织块或者器官，在平 衡盐溶液或者培养液中洗涤，除去血污， 剔除脂肪、被膜结缔组织以及坏死的组 织。可滴加培养液或者平衡盐溶液来保 持湿润； • B. 将组织块放置于盛有培养液的培养皿中， 剪碎，（接种），组织碎块和培养液一 起移到离心管中，吸去上清液；