土壤微生物学特征的测定

土壤微生物学特征的测定
一土壤微生物量碳、氮的测定
将新鲜的土壤样品含水量调节至田间含水量的30%~50%，25℃下密封预培养7~10d,以保持土壤均匀和不同的地方所得结果的可比性。

然后迅速测定土壤微生物
量碳氮，或在低温4℃下保存。

采用氯仿熏蒸-K
2SO
4
提取法测定土壤微生物量碳氮，
即称取预处理的湿润土壤每份20.0g（烘干基重）放入50ml烧杯中，将其置于底部有少量NaOH、少量水（约200ml）和去乙醇氯仿的真空干燥器中，抽真空后保持氯仿沸腾3-5min；然后，将干燥器移置在黑暗条件下25℃熏蒸土壤24h，再次抽真空完全去除土壤中的氯仿。

将熏蒸好的土壤转移到200ml提取瓶中，加入约80ml
0.5mol/LK
2SO
4
提取液（土水比为1∶4），振荡30min后过滤，得土壤提取液每份土
样重复3次。

同时做未熏蒸空白和试剂空白。

土壤微生物量碳：用重铬酸钾氧化法测定
吸取10ml土壤提取液于150ml消化管中，加入0.2mol/LKCrO和浓硫酸各5.0ml，再加入少量沸石，混匀，于175℃磷酸浴中煮沸10min。

冷却后全部移入150ml三角瓶中，使总体积约80ml，加入2滴邻啡罗啉指示剂，用0.05mol/LfeSO滴定至砖红色。

土壤微生物量碳（Bc）=Ec/Kc，Ec表示未熏蒸与熏蒸对照土壤的浸取有机碳的差值，Kc未转换系数，取值0.38。

土壤微生物量氮：用凯氏定氮法测定
取20ml土壤提取液于250ml消化管中，加入0.19mol/LcuSO溶液0.4ml、浓硫酸6.7ml 消化至澄清，冷却后进行定氮。

土壤微生物量氮（Bn）=En/Kn，En为熏蒸与未熏蒸对照土壤矿质态氮的差值，Kn为转换系数，取值0.45。

二土壤酶活性的测定
土壤过氧化氢酶活性用高锰酸钾滴定法、脲酶活性用靛酚蓝比色法测定。

过氧化氢酶活性以20min后每克土消耗。

0.02mol/L高锰酸钾毫升数表示，脲酶活性一24h后每百克土NH
3
-N的毫克数表示。

每各土样重复三次测定。

三土壤基本理化性状测定
一、土壤pH值的测定
土壤样品用水浸提或用中性盐溶液浸提（如酸性土壤可用1mol／L氯化钾溶液；中性和碱性土壤可用0．0lmol／L氯化钙溶液浸提）。

水土比一般为2.5：1；盐碱土水土比5：1；泥炭为10：1。

经充分搅拌，平衡30min，用酸度计或pH计测定
[试剂配制]：
1 、pH4.01标准缓冲溶液：将10.21g苯二甲酸氢钾（KHC8H4O4，分析纯，105℃烘干）溶于1000m1蒸馏水中。

2、 pH6．87标准缓冲溶液：将3．39g磷酸二氢钾（KH2PO4，分析纯，45℃烘干）和3.53g无水磷酸氢二钠（Na2HP4，分析纯，45℃烘干）溶于1000m1蒸馏水中。

3、pH9.18标准缓冲溶液：称取3.80g硼砂（Na2B4O7·10H2O溶于1000ml煮沸冷却的蒸馏水中。

装瓶密封保存。

4、1mol/L氯化钾溶液：将74.6g氯化钾（KCl，分析纯）溶于1000m1蒸馏水中。

该溶液的pH值为5.5-6.0
5、0.01mol/L氯化钙溶液：将147.02g氯化钙（CaCl2·2H2O，分析纯）溶于1000ml 蒸馏水中，即1mol／L氯化钙溶液。

取10ml 1mol／L氯化钙溶液于500ml烧杯中，加入500ml蒸馏水，滴加氢氧化钙或盐酸溶液调节pH＝6，然后用蒸馏水定容至1000ml，即0.01mol／L氯化钙溶液。

[仪器] pH计或酸度计；pH复合电极（或pH玻璃电极和甘汞标准电极）。

[样品处理] 将土壤样品风干磨细过2mm筛，称取10．0g样品于50ml烧杯中，加入25ml无二氧化碳的蒸馏水或1mol／L氯化钾溶液（酸性土壤），或0．01mol ／L氯化钙溶液（中性和碱性土壤），用玻璃棒剧烈搅拌1-2min，静置30min，以备测定。

此时应注意实验室氨气和挥发性酸雾的影响。

[测定] 按仪器说明书开启pH计（或酸度计），选择与土壤浸提液pH值接近的pH标准缓冲溶液（酸性的用pH4.01缓冲溶液，中性的用pH6.87缓冲溶液，碱性的用pH9.18缓冲溶液）作为标准，校正仪器指示的pH值与标准值一致。

将pH计的复合电极（或pH玻璃电极和甘汞标准电极）插入土壤浸提液中，轻轻转动烧杯，读出pH值。

每份样品测定后，用蒸馏水冲洗电极，并用滤纸将水吸干。

[计算] pH计读出的pH值。

[备注] 1．分析精度0．1pH值，但精密的pH计可准至0．02pH单位，并使用温度补偿。

2．土壤样品不要磨得过细，以2mm筛为宜。

磨好的样品如果不能马上测定，应装瓶密封保存，以防的空气中的氨气和挥发性酸影响。

电极插入土壤浸提液后轻轻转动烧杯是必要的，可加速平衡时间，这对于缓冲性较弱或pH较高的土壤尤为重要。

若用标准甘汞电极作参比电极时，一定要插在上部溶液中，以减少误差。

二、有机质的测定
仪器、设备及试剂
1.仪器与设备
硬质试管，油浴消化装置(包括油浴锅和铁丝笼)，可调温电炉，秒表，自动控温调节器。

2.试剂
(1)0.800 0mol·L－1重铬酸钾标准溶液：称取经130℃烘干的重铬酸钾(K
2Cr
2
7
，分
析纯)39.2245g溶于水中，定容至1000mL。

(2)0.2mol·L-1FeS0
4溶液：称取硫酸亚铁(FeS0
4
·7H
2
0，化学纯)56.0g溶于水中，
加浓硫酸5mL，稀释至1 L。

(3)指示剂
①邻啡罗啉指示剂：称取邻啡罗啉(分析纯)1.485 g与FeS0
4·7H
2
00.695g，溶于100mL
水中。

②2—羧基代二苯胺(o-phenylanthranilicacid，又名邻苯氨基苯甲酸，C
13H
11
O
12
N)
指示剂：称取0.25 g试剂于小研钵中研细，然后倒人100mL小烧杯中，加入0.1mol·L －1NaOH溶液12mL，并用少量水将研钵中残留的试剂冲洗人100mL烧杯中，将烧杯放在水浴上加热使其溶解，冷却后稀释定容到250mL，放置澄清或过滤，用其清液。

方法和步骤
1.样品制备
称取通过0.149mm(100目)筛孔的风干土样0.1～1g(精确到0.0001g)，分别放人6—8支干燥的硬质试管中，用移液管准确加入0.8000mol·L－1重铬酸钾标准溶液
5mL(如果土壤中含有氯化物需先加(Ag
2S0
4
0.1g)，用注射器加入浓H
2
S0
4
5mL充分摇
匀，管口盖上弯颈小漏斗。

2.测定
①将置于铁丝笼中的8～10支试管(每笼有1—2个空白试管)，放人温度为185～190℃的石蜡油浴锅中，并控制电炉，使油浴锅内温度始终维持在170～180℃，待试管内液体沸腾发生气泡时开始计时，煮沸 5 min，取出试管，稍冷后擦净试管外部油液。

②冷却后，将试管内物质倾人250mL三角瓶中，用水洗净试管内部及小漏斗，使三角瓶内溶液总体积达到60～70mL，保持混合液中硫酸浓度为2～3mol·L－1，然后加入2—羧基代二苯胺指示剂12～15滴，此时溶液呈棕红色。

用标准的0.2mol·L－1硫酸亚铁滴定，滴定过程中不断摇动三角瓶，直至溶液的颜色由棕红经紫色变为暗绿(灰蓝绿色)，即为滴定终点。

如用邻啡罗啉指示剂，加指示剂2～3滴，溶液的变色过程中由橙黄一蓝绿一砖红色即为终点。

记取Pem4滴定毫升数(y)。

每一批样品测定的同时，进行2～3个空白试验，即取0.5g粉状二氧化硅代替土样，其他步骤与试样测定相同。

记取FeS0
4
滴定毫升数(Vo)，取其平均值。

3.计算
土壤有机碳(g/kg)= c×5(V0 - V) /V0×0.003×1.1×1000/mk
式中： c——重铬酸钾标准溶液的浓度，mol·L-1
Vo——空白滴定用去FeS0
4
体积，mL；
3.0——1/4碳原子的摩尔质量，g·mol-1
1.1——氧化校正系数；
m——风干土样质量，g；
k——将风干土换算成烘干土的系数。

∴土壤有机质(g·kg-1)＝土壤有机碳(kg-1)Х1.742
式中：1.724为土壤有机碳换成土壤有机质的平均换算系数。

注意事项
①含有机质高于50g·kg-1者，称取土样0.1 g，含有机质为20～30g·kg-1者，称土样0.3g，少于20g·kg-1者称取0.5g以上。

②土壤中氯化物的存在可使结果偏高。

因为氯化物也能被重铬酸钾所氧化，因此，
盐土中有机质的测定必须防止氯化物的干扰，少量氯可加入少量Ag
2SO
4
，使氯根沉
淀下来。

Ag
2SO
4
的加入，不仅能沉淀氯化物，而且有促进有机质分解的作用。

Ag
2
SO
4
的用量不能太多，约加0.1g，否则生成Ag
2Cr
2
O
7
沉淀，影响滴定。

③必须在试管内溶液表面开始沸腾才开始计算时间。

掌握沸腾的标准尽量一致，然后
继续消煮5min，消煮时间对分析结果有较大的影响，故应尽量记时准确。

④消煮好的溶液颜色，一般应是黄色或黄中稍带绿色，如果以绿色为主，则说明重铬酸钾用量不足。

在滴定时若消耗硫酸亚铁量小于空白用量的1／3，有氧化不完全的可能，应弃去重做。

三、土壤全氮的测定
1 测定原理
样品在加速剂的参与下，用浓硫酸消煮时，各种含氮有机化合物，经过复杂的高温分解反应，转化为铵态氮。

碱化后蒸馏出来的氨用硼酸吸收，以酸标准溶液滴定，求出土壤全氮含量（不包括全部硝态氮）。

包括硝态和亚硝态氮的全氮测定，在样品消煮前，需先用高锰酸钾将样品中的亚硝态氮氧化为硝态氮后，再用还原铁粉使全部硝态氮还原，转化成铵态氮。

2.1 土壤样品粉碎机；
2.2 玛瑙研钵；
2.3 土壤筛：孔径1.0mm（18目）；0.25mm（60目）； 2.4 分析天平：感量为0.0001g；
2.5 硬质开氏烧瓶：容积50ml，100ml；
2.6 半微量定氮蒸馏装置；
2.7 半微量滴定管：容积10ml，25ml；
2.8 锥形瓶：容积150ml；
2.9 电炉：300W变温电炉。

3 试剂
3.1 硫酸（GB 625—77）：化学纯；
3.2 硫酸（GB 625—77）或盐酸（GB 622—77）：分析纯，0.005mol/L硫酸或0.01mol/L盐酸标准溶液；
3.3 氢氧化钠（GB 629—81）：工业用或化学纯，10mol/L氢氧化钠溶液；
3.4 硼酸-指示剂混合液；
3.4.1 硼酸（GB 628—78）：分析纯，2％溶液（W/V）；
3.4.2 混合指示剂：0.5g溴甲酚绿（HG3—1220—79）和0.1g甲基红（HG3—958
—76）于玛瑙研钵中，加入少量95％乙醇，研磨至指示剂全部溶解后，加95％乙醇至 100ml。

使用前，每升硼酸溶液中加20ml混合指示剂，并用稀碱调节至红紫色（pH 值约4.5）。

此液放置时间不宜过长，如在使用过程中pH值有变化，需随时用稀酸或稀碱调节之。

3.5 加速剂：100g硫酸钾（HG 3—920—76，化学纯），10g五水合硫酸铜（GB 665 —78，化学纯），1g硒粉（HG3—926—76）于研钵中研细，必须充分混合均匀。

4 土壤样品的制备
将通过孔径1mm（18目）筛的土样，在牛皮纸上铺成薄层，划分成多个小方格。

用小勺于每个方格中，取等量的土样（总量不得少于20g）于玛瑙研钵中研磨，使之全部通过0.25mm筛。

混合均匀后备用。

5 测定步骤
5.1 称取风干土样（通过0.25mm筛）1.0×××g（含氮约1mg），同时测定土样水分含量。

5.2 土样消煮
不包括硝态和亚硝态氮的消煮：
将土样送入干燥的开氏瓶底部，加少量无离子水（约0.5～1ml）湿润土样后，加入2g加速剂和5ml浓硫酸，摇匀。

将开氏瓶倾斜置于300W变温电炉上，用小火加热，待瓶内反应缓和时（约10～15min），加强火力使消煮的土液保持微沸，加热的部位不超过瓶中的液面，以防瓶壁温度过高而使铵盐受热分解，导致氮素损失。

消煮的温度以硫酸蒸气在瓶颈上部1/3处冷凝回流为宜。

待消煮液和土粒全部变为灰白稍带绿色后，再继续消煮1h。

消煮完毕，冷却，待蒸馏。

在消煮土样的同时，做两份空白测定，除不加土样外，其他操作皆与测定土样时相同。

5.3 氨的蒸馏
5.3.1 蒸馏前先检查蒸馏装置是否漏气，并通过水的馏出液将管道洗净。

5.3.2 待消煮液冷却后，用少量无离子水将消煮液定量地全部转入蒸馏器内，并用水洗涤开氏瓶4～5次（总用水量不超过30～35ml）。

于150ml锥形瓶中，加入5ml2％硼酸-指示剂混合液，放在冷凝管末端，管口置于硼酸液面以上3～4cm处。

然后向蒸馏室内缓缓加入20ml10mol/L氢氧化钠溶液，通入蒸汽蒸馏，待馏出液体积约50ml时，即蒸馏完毕。

用少量已调节至pH4.5的水洗涤冷凝管的末端。

5.3.3 用0.005mol/L硫酸（或0.01mol/L盐酸）标准溶液滴定馏出液由蓝绿色至刚变为红紫色。

记录所用酸标准溶液的体积（ml）。

空白测定所用酸标准溶液的体积，一般不得超过0.4ml。

6 测定结果的计算
6.1 计算公式
土壤全氮（％）＝〔（V－V0）×CH×0.014/m〕×100
式中：V──滴定试液时所用酸标准溶液的体积，ml；
V0── 滴定空白时所用酸标准溶液的体积，ml；
CH── 酸标准溶液的浓度，mol/L；
0.014── 氮原子的毫摩质量；
m── 烘干土样质量，g。

6.2 平行测定结果，用算术平均值表示，保留小数点后三位。

6.3 平行测定结果的相差：土壤含氮量大于0.1％时，不得超过0.005％；含氮0.1～0.06％时，不得超过0.004％；含氮小于0.06％时，不得超过0.003％
四、土壤全磷的测定
HCLO
4-H
2
SO
4
—钼锑抗比色法：
（1）方法要点：在高温条件下，土壤中含磷矿物和有机磷化合物与高沸点的H
2SO
4
和强氧化剂HCLO
4
作用，使之完全分解，全部转化为正磷盐而进入溶液，然后用钼锑抗比色法测定。

（2）主要仪器：分光光度计，2KVA方电炉，3KVA调压变压器。

（3）试剂： A．浓H
2SO
4
（二级）。

B．HCLO
4
（二级，70~72%）。

C．钼锑贮存液。

浓H
2SO
4
（二级）153毫升缓慢倒入约400毫升水中，搅拌，冷却。

10克钼酸铵（二
级）溶解于约60℃的300毫升水中，冷却。

然后将H
2SO
4
溶液缓缓倒入钼酸铵溶液
中，再加入100毫升0.5%酒石酸锑钾溶液，最后用水移释至1升，避光贮存。

此贮
存液含1%钼酸铵，5.5摩尔 /升1/2 H
2SO
4。

D．钼锑抗显色剂。

1.50克抗坏血酸溶
液于100毫升钼锑贮存液中。

此液须随配随用，有效期一天。

E．二硝基酚指示剂。

0.2克2，6-二硝基酚或2，4二硝基酚溶于1000毫升水中。

F．5ppmP标准溶液。

0.4390克KH
2PO
4
（二级，105。

C烘过2小时）溶于200毫升水中，加入5毫升浓H
2
SO
4
，
转入1升容量瓶中，用水定容。

此为100ppmP标准溶液，可以长期保存。

取此溶液准确稀释20倍，即为5ppmP标准溶液，此溶液不宜久存。

（4）操作步骤：A．待测液的制备：称取通过100目的烘干土壤样品1克（精确到
0.0001克）置于50毫克三角瓶中，以少量水湿润，加入浓H
2SO
4
8毫升，摇动后（最
好放置过夜）再加入70~72%的HCLO
410滴，摇匀，再加热消煮。

缓慢升温，HCLO
4
烟雾消失后，再提高温度，使H2SO4发烟回流，待瓶内溶液开始转白后继续消煮20分钟，全部消煮时间为45~60分钟。

将冷却后的消煮液用水小心地冲入100毫升容量瓶中，冲洗时用水应量少次多，轻轻摇动容量瓶，待完全冷却后，以水定容，用干燥漏斗和无磷滤纸将溶液滤入干燥的100毫升三角瓶中。

同时做空白试验。

B．测定：取上述待测液2~10毫升（含5~25微克 P）于50毫升容量瓶中，用水稀释至约
30毫升，加二硝基酚指示剂2滴，用稀NaOH溶液和稀H
2SO
4
溶液调节pH值至溶液
刚呈微黄色。

然后加入钼锑抗显色剂5毫升，摇匀，用水定容，。

在室温高于15℃的条件下放置30分钟后，在分光光度计上用波长700纳米比色，以空白试验溶液为参比液调零点，读取吸假值。

在工作曲线上查出显色液的Pppm数。

颜色在8小时内可保持稳定。

C．工作曲线的绘制：分别吸取5ppm标准溶液0、1、2、3、4、5、6、8、10毫升于50毫升容量瓶中，加水稀释至约30毫升，加入钼锑抗显色剂5毫升，摇匀，定容。

即得0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.8、1.0ppmP标准毓溶液，与待测液同时比色，读取吸收值。

在方格坐标纸上以吸收值为纵坐标，Pppm数为横坐标纸上以吸收值为纵坐标，Pppm数为横坐标，绘制成工作曲线。

计算：土壤全磷量（g/kg）=ρⅹVⅹV
2ⅹ10-3/V
1
m
式中：ρ——待测液中磷的质量浓度（μg/ml）
V——样品制备溶液的ml数
m——烘干土质量（g）
V
1
——吸取滤液ml数
V
2
——显色的溶液体积（ml）
10-3——将μg数换算成每kg土壤中含磷量的g数的乘数。