Cav1.2通道CT1片断突变体的质粒构建和蛋白表达

Cav1.2通道CT1片断突变体的质粒构建和蛋白表达

雷明;赵美眯;封瑞;王红梅;毛楠;朱彤;郝丽英

【摘要】目的构建心肌Cav1.2通道CT1片段及其突变体与谷胱甘肽转移酶(GST)重组的融合蛋白原核表达载体,并进行蛋白表达和纯化.方法以豚鼠Cav1.2通道CT1质粒(pGEX?6p?3/CT1)为模板,采用定点突变技术构建CT1 T1603A和CT1 T1603D两种突变体质粒.转化大肠杆菌BL21感受态细胞,大量培养后用IPTG诱导GST融合蛋白表达,分离纯化后采用SDS?PAGE检测CT1及其突变体蛋白的相对分子量和纯度.结果 CT1片段及其突变体融合蛋白得到了正确、大量表达,提取纯化后的CT1片段及其突变体融合蛋白具有较高的纯度.结论成功构建了Cav1.2通道CT1片断及其突变体融合蛋白原核表达载体,获得了CT1突变体融合蛋白,为深入研究CT1片断在Cav1.2通道调节中的作用和机制奠定基础.%Objective To construct prokaryotic expression vectors of the CT1 fragment of Cav1.2 channel and its mutants for CT1?GST fusion pro?tein expression and purification. Methods Taking plasmid of pGEX?6p?3/CT1 as template,two mutational plasmids(CT1?T1603A and CT1?T1603D)with site directed mutagenesis were constructed. The plasmids were then transformed to E.coli BL21 competent cells,and the transfor?mants were induced with IPTG for the expression of GST fusion proteins of CT1 fragment and its mutants. SDS?PAGE was performed to determine the relative molecular weight and purity. Results Mutated bases corresponding to the target amino acid site were confirmed by cDNA sequence. High purity of GST?CT1 fusion protein and its mutants were successfully obtained. Conclusion Prokaryotic expression vectors of CT1 fragment and its mutants were constructed,and

the fusion proteins were successfully expressed were obtained. These results provided a basis for further studies of the function of CT1 fragment in the regulation for Cav1.2 channel and its mechanism.

【期刊名称】《中国医科大学学报》

【年(卷),期】2015(044)009

【总页数】4页(P837-839,843)

【关键词】融合蛋白;CT1;突变体

【作者】雷明;赵美眯;封瑞;王红梅;毛楠;朱彤;郝丽英

【作者单位】中国医科大学药学院药物毒理学教研室,沈阳 110122;中国医科大学

药学院药物毒理学教研室,沈阳 110122;中国医科大学药学院药物毒理学教研室,沈阳 110122;中国医科大学药学院药物毒理学教研室,沈阳 110122;中国医科大学药

学院药物毒理学教研室,沈阳 110122;东北大学环境生物学教研室,沈阳 110004;中国医科大学药学院药物毒理学教研室,沈阳 110122

【正文语种】中文

【中图分类】R966

电压依赖性钙通道（voltage-dependent Ca2+channel，VDCC）按照电生理特性分为低电压依赖型及高电压依赖型2种，按照药理学及生物物理学特性分为T、L、N、P/Q和R型［1，2］，其中L型钙通道（L-type Ca2+channel，LTCC）可以被二氢吡啶类药物硝苯地平所阻断，也称为二氢吡啶受体。LTCC是研究最为广泛的高电压依赖型钙通道之一，存在于大多数可兴奋细胞膜上，如骨骼肌、心脏、脑、内分泌细胞、神经元及其他组织。在心肌细胞中，L型钙通道介导的钙离子内

流触发肌浆网钙释放通道ryanodine受体开放，肌浆网存储的钙离子大量释放，

这种级联效应称为“钙致钙释放”（Ca-induced Ca2+release，CICR），在心脏的兴奋收缩耦联（excitationcontraction couple，EC）中起着关键性作［3］，LTCC的调节方式多种多样，异常复杂［4，5］。

前期研究［6～8］发现，钙离子、钙调蛋白（calmodulin，CaM）、钙离子/钙

调蛋白依赖的蛋白激酶Ⅱ（Ca/ calmodulin-dependent protein kinasesⅡ，CaMKⅡ）等都是通过与LTCC C末端的CT1（1 509～1 789）片段特定的氨基

酸或氨基酸序列相互作用发挥调节功能。CaM可直接与心肌细胞Cav1.2钙通道CT1片段结合，从而对钙通道钙离子依赖性易化作用进行调节［9，10］，CaMKⅡ通过磷酸化CT1片段上的1 603位苏氨酸以调节钙通道的功能［11］。

为了更好研究1 603位苏氨酸在Cav1.2钙通道调节中的作用，本研究以豚鼠

Cav1.2通道CT1为模板，采用定点突变技术将1 603位苏氨酸分别突变为丙氨酸（CT1 T1603A）和天门冬氨酸（CT1 T1603D），模拟其去磷酸化和磷酸化状态，制备纯化蛋白并进行相应的活性鉴定，为研究Cav1.2钙通道的磷化调节奠定基础。

1.1 材料

原核表达质粒pGEX-6p-3/CT1和BL21菌株由本实验室保存。异丙基硫代-β-D

半乳糖苷（isopropyl β-D-thiogalactoside，IPTG）、溶菌酶（1ysozvme，LYS）、二硫苏糖醇（dithiothreitol，DDT）、N-十二烷基肌氨酸钠（N-laurylsarcosine，N-Lau）、氨苄西林（ampicillin，Amp）均购自美国Sigma

公司；PreScission Pmtease和GS-4B beads购自德国GE Healthcare公司；胰蛋白胨、酵母提取物购自英国OXOID公司；其他试剂均购自美国BIOSHARP公司。CT1定点突变由本研究组提供原始质粒作为模板和突变位置信息，由上海生

工生物工程股份有限公司代为完成突变和序列测定。

1.2 BL21感受态细胞的转化