脉冲场凝胶电泳技术

注意事项：
（1） 用后的接种环要放在指定的废弃物容器中。
（2） 细胞悬浊液、蛋白酶K要置于冰上。
（3） 在混合细胞悬浊液和1% Seakem Gold：
1%SDS时要避免气泡的产生。
（4） 混合物加入模具时不能产生气泡。 （5） 在加1% Seakem Gold：1%SDS的过程中 1% Seakem Gold：1%SDS要一直放在56℃水浴箱 中。
（二）将胶块直接加在加样孔内
1、 调整梳子的高度，使梳子齿与胶槽的底面有一 定间距。用水平仪调整胶槽使其水平。 2、 把梳子放入胶槽，从胶槽的中央缓慢倒入 100ml熔化的在55℃－60℃平衡的1％SKG。避免 气泡的生成；如果有，用枪头消除。在室温下凝固 30分钟左右。 3、 小心拔出梳子。 4、 从37℃水浴中取出胶块，平衡到室温。 5、 用枪头吸出酶切混合液，避免损伤或吸出胶块。 6、 每块胶加入200µl 0.5×TBE平衡。 7、 用小铲将胶块加入加样孔。 8、 用溶化的胶封闭加样孔,记录加样顺序
早期研究DSB的方法主要有粘弹性测量法、
速度沉降法、中性滤膜洗脱法,这些方法稳定 性差,灵敏度低。 随着PFGE的出现,辐射引起的DNA断裂过程 才得到了详细的研究。利用PFGE可以测量 DNA双链断裂后DSBs的分布研究辐射引起的 DNA断裂片段释放的比例(FAR)和DNA断裂 片段平均长度随照射剂量的变化规律。

这一独具的高分辨力使PFGE的应用范围已涉及到几 乎所有生物基因组结构的研究。
PFGE的原理
PFGE的基本原理是对琼脂糖凝胶外加交变的脉冲电场, 其方向、时间和电流大小交替改变,每当电场方向发生改 变时,大分子DNA便滞留在凝胶孔内,直至沿新的电场轴重 新定向后,才能继续向前泳动,DNA分子越大,这种重新定向 需要的时间就越长,当DNA分子改变方向的时间小于脉冲 时间时,DNA就可以按照其分子量大小分开,经EB染色后 在凝胶上出现按DNA大小排列的电泳带型。

四、胶块内DNA的酶切 1、 在1.5ml eppendorf管上标记好相应的样品及 H9812的名称。 2、 按照下面的比例配制缓冲液H的稀释液，混匀。 试剂 µl/胶块 µl /10胶块 纯水 180µl 1800µl Buffer D 20µl 200µl 总体积 200µl 2000µl 注意：缓冲液要置于冰上。
蛋白酶K（储存液浓度为20mg/ml）混匀，使其终浓
Hale Waihona Puke Baidu
度为0.5mg/ml。
7、 制备好1%Seakem Gold：1%SDS，放于56℃
水浴箱中。
8、 在eppendorf管中加入400µl的1% Seakem Gold：1%SDS，用枪头轻轻混匀。 9、 将混合物加入模具，避免气泡产生，在室温下 凝固10-15分钟。

六、电泳 1、 确保电泳槽是水平的。如果不水平，调整槽底 部的旋钮。 2、 加入2.2L 0.5×TBE,关上盖子。 3、 打开主机和泵的开关，确保泵设在－70（这时 缓冲液的流速约1L/分钟）和缓冲液在管道中正常循 环。 4、 打开冷凝机，确保预设温度在14℃（缓冲液达 到该温度通常需要20分钟左右）。 5、 打开胶槽的旋钮，取出凝固好的胶，用吸水纸 清除胶四周和底面多余的胶，小心的把胶放入电泳 槽，关上盖子。 6、 设置电泳参数。 7、 记录电泳初始电流（通常120－145ma）。 8、 结束电泳：关机顺序为：冷凝机－泵－主机。
调整至3.6~4.5。如果OD值大于4.5，加入CSB稀释；如果
OD值小于3.6，增加菌量提高其浓度。 5、 取400µl细菌悬浊液于相应的1.5ml eppendorf管中，置 于37℃水浴中孵育5分钟。将剩余的细菌悬浊液置于冰上直 到胶块制备好放在水浴摇床中。

6、 从水浴箱中取出eppendorf管，每管加入20µl

Tenover等提出了有关PFGE图谱与测定菌株
相关性的判别标准,根据电泳条带可分为:如 PFGE图谱一致,说明为相同菌株;有1~3条带 的差异说明菌株间有相近关系,且只有单基因 的改变;4~6条带的差异说明菌株间可能有相 近关系,表示出有2个独立基因的差异;如菌株 间有6条或更多条带差异,说明有3个或更多的 基因差异,视为无相关性。

七、图像的获取 1、 取出胶，放在盛放400ml EB溶液的托盘内 （EB储存液浓度为10mg/ml，1：10,000稀释，即 在400ml水中加入40µl储存液）。 2、 将托盘放在摇床上摇25-30分钟。 3、 放掉电泳槽中的TBE，用1-2L纯水清洗电泳槽， 并倒掉液体。 4、 戴上手套将用后的EB溶液小心倒入做有标记 的棕色瓶中，在托盘中加入400-500ml纯水，放在 摇床上脱色60-90分钟，如果可能每20-30分钟换一 次纯水。 5、 用Gel Doc 2000拍摄图像。 6、 转换成*.1sc文件用于处理分析。
确保胶块在液面的下面。
10、 在37℃水浴中孵育至少2小时。
五、加样
（一）将胶块直接粘在梳子齿上 1、 调整梳子的高度，使梳子齿与胶槽的底 面相接触。用水平仪调整胶槽使其水平。 2、 从37℃水浴中取出胶块，平衡到室温。 3、 用枪头吸出酶切混合液，避免损伤或吸 出胶块。 4、 每管加入200µl 0.5×TBE。

低熔点琼脂糖在这个过程中阻止了机械力对DNA大
片段的剪切作用,因而细胞裂解所释放的DNA大片段
包埋在胶栓中。制作好的样品插块可以在电泳时直
接插入加样孔中
PFGE的操作步骤
PFGE的简要操作步骤包括样品的包埋、原
位裂解、稀少酶切位点的限制性内切酶对染
色体DNA的消化、脉冲场电泳、凝胶的EB染
色观察5个步骤。
PFGE的方法

常规的DNA制备方法得不到完整的大分子量DNA,因 为DNA大片段很脆弱,容易因提取过程中的机械作用 如吸打、离心等而导致DNA的断裂。

为了得到完整的大量DNA大片段,目前主要是采用低 熔点琼脂糖(Lowmelting point agarose)包埋样品,再
进行原位裂解和去蛋白处理从而释放DNA
脉冲场凝胶电泳技术
生科院遗传学 胡银松
脉冲场凝脉电泳
(Pulsed field gelelectrophoresis,PFGE), 是近年发展起来的一种重要的分离大分子量 线性DNA分子的电泳技术。
普通的琼脂糖凝胶电泳分离DNA分子的上限
是50 kb
大于该极限的DNA分子,常规的琼脂糖凝胶便

5、 把梳子平放在胶槽上，把胶块加在梳子齿上。 如果用的是10个齿的梳子，把标准菌株H9812加在 第1、5、10个齿上。 6、 用吸水纸的边缘吸去胶块附近多余的液体，在 室温下风干约3分钟。 7、 把梳子放入胶槽，确保所有的胶块在一条线上， 并且胶块与胶槽的底面相接触。从胶槽的下部中央 缓慢到入100ml熔化的在55℃－60℃平衡的1％ SKG。避免气泡的生成；如果有，用枪头消除。在 室温下凝固30分钟左右。 8、 记录加样顺序。
近年来随着分子生物学技术的发展,基因分型
技术日渐受到青睐。现代的分子分型技术主 要有:①基于限制性内切酶的分型技术:PFGE 分型和RFLP分型;②基于PCR的分型技术: RAPD分型、Rep-PCR分型、AFLP分型;③ 基于核苷酸序列分析的分型技术:SLST分型 和MLST分型。
PFGE分型技术因其重复性好、分辩力强被誉为细 菌分子分型技术的“金标准”,并推荐作为金黄色葡 萄球菌等病原微生物分型的标准技术。 PFGE分型技术的不足是:耗时,需要2~4 d的样品制 备时间;设备价格昂贵,难以推广;对分析大小相似的 片段分辨力不是很高。 目前,美国PulseNet已创建病原菌PFGE图谱数据库, 通过与数据库中病原菌PFGE图谱的比较,可以判断 菌株间染色体DNA的相似程度。
7、 将管子放在37℃水浴中孵育10-15分钟。

8、 在用稀释缓冲液孵育的过程中，按照以下的比例配制酶
切缓冲液，混匀。 试剂 µl/胶块 µl /10胶块
纯水 175µl 1750µl
Buffer D 20µl 200µl 酶（10U/µl） 5µl 50µl 总体积 200µl 2000µl 9、 每管加入200µl混合液，轻轻在实验台上磕管子的底部，
该标准有一定的局限性。因为细菌的高变异
性,判断是否是同一菌株时允许一定的变异存 在。Fred在解释PFGE图谱时提出85%以上 条带相同的为相同菌株,50%以上条带不相同 的为不同菌株。
2
PFGE在DNA辐射损伤和修复研究中的应用
在电离辐射的作用下,DNA分子将产生多种类型的损 伤,包括碱基损伤、DNA单链断裂(SSB)和双链断裂 (DSBs)、DNA-DNA交联以及DNA-蛋白质交联等。 辐射生物效应分子模型的提出者Leenhouts和 Chadwick认为,电离辐射诱发的许多细胞效应均与 DNA的双链断裂有关,所以,DSB及其修复一直是研 究的热点。

二、 细胞的裂解
1、 在50ml的screw-cap tube上做好标记。
2、 配制细胞裂解液（CLB）：每5ml细胞裂解液
加入25µl蛋白酶 K（20mg/ml），使其终浓度为
0.1mg/ml，然后颠倒混匀。
3、 每个管子加入5ml蛋白酶K/CLB混合液。

4、 如果想使胶块平齐，可以用刀片削去模具表面
传统的微生物分型技术主要是基于表型特性
分类,如生化分型(biotyping)、血清学分型 (serotyping)、耐药谱测定(antmi icrobial susceptibility testing)、噬菌体分型 (bacterialphage typing)等。由于微生物易受环 境的影响,很容易改变其表达性状,使得表型分 类很不准确。
多余的部分。
5、 保证胶块在液面下而不在管壁上。
6、 将管子放在54℃水浴摇床中孵育2小时，转速
约170转/分钟。
7、 将纯水和TE放在50℃水浴摇床中预热。

三、洗胶块 1、 从水浴摇床中拿出screw-cap管，盖上绿色的 screened-cap。轻轻倒掉CLB。在实验台上轻磕管 底使胶块落在管底。 2、 每管中加入15ml预热的纯水。 3、 确保胶块在液面下而不在管壁或盖子上，放回 50℃水浴摇床中，摇10分钟。 4、 倒掉水，用纯水再洗一次。 5、 倒掉水，加入15ml预热的TE，在50℃的水浴 摇床中摇15分钟。 6、 倒掉TE，用TE重复洗三次，每次10－15分钟。 7、 倒掉TE，加入10ml TE，放在4℃冰箱保存备 用。
胶块的制备

1、 在Falcon 2054管上标记样品名称和空白对照，
分别加入约2ml细胞悬浊液（CSB）；
2、 在1.5ml eppendorf管上标记好对应样品的名称；
3、 在模具上标记好对应样品的名称；

4、 用CSB湿润接种环，从培养皿上刮取适量细菌，均匀悬 浊于CSB中，用bioMerieux Vitek colorimeter测其OD值，并
PFGE的应用
PFGE具有独特的分离大片段DNA的能力,是
一种分析染色体DNA强有力的工具。目 前,PFGE主要应用于染色体DNA的分离、微 生物基因分型、DNA辐射损伤修复、细胞凋 亡、酵母人工染色体电泳分析及单向电场泳 难以分辨的DNA图谱制作等研究中。现简述 以下几个方面。
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PFGE在分子分型方面的应用 通过微生物分型可以鉴定菌株是否一致、比 较它们的亲缘关系,对于细菌性传染病的监测、 传染源追踪、传播途径的调查和识别有着非 常重要的意义。
失去了其分子筛的作用,导致电泳带型无法 分辨，PFGE的发明正好解决了这一问题。

1984年, Schwartz和Cantor首次用此技术成功分离 得到酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)细胞 的16条完整染色体DNA。

此后,随着PFGE技术的不断改进,现已具有分辨出高 达10Mb级DNA的能力。

3、 在每个1.5ml eppendorf管中加入200µl缓冲液H 的稀释液。 4、小心从TE中取出胶块放在干净的培养皿上。 5、 用刀片切下2mm宽的胶块放入1.5ml eppendorf 管中。确保胶块在液面下面。将剩余的胶块放回原
来的TE中。
6、 用同样的方法处理标准株H9812的胶块。