蛋白质电化学检测的新体系研究及应用

蛋白质电化学检测的新体系研究及应用

王学亮1,2,焦奎1,孙伟1(1.青岛科技大学化学与分子工程学院,青岛266042;

2.菏泽学院化学与化工系,菏泽274015)

摘要:在pH 3.5 B-R缓冲溶液中以溴百里香酚蓝为电化学探针建立了蛋白质测定新体系。溴百里香酚蓝在-0.458 V(vs.SCE)有一个灵敏的极谱伏安还原峰,加入人血清白蛋白(HSA)后,其峰电位不变而峰电流下降。峰电流的下降值同HSA质量浓度在 1.0~40.0 mg·L-1范围内呈线性关系,其回归方程为ΔI p″=133.52C-3.72,r=0.999,定量下限为1.0 mg·L-1。由试验结果求得蛋白质与溴百里香酚蓝相互作用的结合比为1∶4,结合常数βs=1.43×1019。应用于实际人血清样品的测定,结果与经典的考马斯亮蓝G-250光度法一致。此方法还可应用于牛血清白蛋白、牛血红蛋白、卵清白蛋白等的测定。

关键词:蛋白质;溴百里香酚蓝;电化学探针

Study of New Electrochemical Analytical System for Determination Protein and Its Analytical Application

W ANG Xue-liang1,2, JIAO Kui1, SUN Wei1

(1. College of Chemistry and Molecular Engineering, Qingdao University of Science and Technology, Qingdao266042,China; 2. Dept. of Chem. and Chem. Engineering, He′ze College, He′ze274015, China)

Abstract:A new analytical system by using bromothymol blue (BTB) as an electrochemical probe in B-R buffer solution of pH 3.5 for determination of protein was proposed. A sensitive voltammetric reductive peak of BTB was observed at -0.458 V (vs.SCE). Upon the addition of human serum albumin (HSA) to the reaction system, the peak potential of BTB was not changed but the peak current was

decreased. It was found that linear relationship between the 2nd derivative of the magnitude of decrease in peak current (ΔI p″) and the increase of mass concentration of HSA in the range within 40.0 mg·L-1as shown by the linear regression equation:ΔI p″=133.52C-3.72 (r=0.999) was obtained. Determination limit of this reaction for HSA was found to be 1.0 mg· L-1. Combination ratio of HSA to BTB was found to be 1∶4, and the combination constant to be 1.43×1019. The proposed method was used in the determination of HSA in blood samples of healthy persons, giving results in consistency with the results obtained by the conventional Comassie brilliant blue G-250 photometric method. This method was also applied to determined other kinds of protein, such as bovine serum albumin (BSA), bovine hemoglobin (BHb), ovalbumin (OV A) and etc.

Keywords: Protein; Bromothymol blue; Electrochemical probe

人血清白蛋白(HSA)占人体血浆的60%,有着非常重要的生理功能,因此,研究其电化学反应有着十分重要的意义。蛋白质与电极之间的电子转移过程,在某种程度上类似于生物体内蛋白质之间的电子转移过程,用电化学方法进行研究是揭示生命本质的较好途径[1],可以为进一步理解生物体内的能量转换和电子传递反应机理提供重要信息。

目前关于蛋白质的研究已有很多报道,如金属离子、染料小分子和药物分子等与HSA或者牛血清白蛋白(BSA)相互作用的光度法研究均已有报道[1-3],但目前用电化学法研究其相互作用的报道相对较少[4-8]。本研究利用酸性条件下蛋白质与溴百里香酚蓝结合生成一种超分子复合物,使溴百里香酚蓝还原峰电流降低,建立了一种测定蛋白质的新方法。对酸度、温度及干扰离子的影响进行了研究,计算了参与电极反应的质子数、溴百里香酚蓝与蛋白质的结合比及反应常数。

本法具有稳定、灵敏、选择性好等优点,并可以排除生化分析中常见的溶血、黄疸等现象的干扰,用于测定人血清样品中蛋白质含量,结果与经典的考马斯亮蓝G-250光度法一致。

1试验部分

1.1仪器与试剂

JP-303极谱分析仪,三电极系统,滴汞电极为工作电极,饱和甘汞电极(SCE)为参比电极,铂丝电极为对电极;CHI 832电化学分析仪,三电极系统,玻碳电极为工作电极,饱和甘汞电极(SCE)为参比电极,铂丝电极为对电极;pHS-25型酸度计。

HSA、BSA、卵清白蛋白(OV A)、脂肪酶(Lipase)、牛血红蛋白(BHb)标准溶液均为水溶液,4℃冰箱保存。

溴百里香酚蓝(BTB)溶液:4.0×10-4mol·L-1;B-R缓冲溶液:0.2 mol·L-1,4.57 mol·L-1磷酸13.55 mL,乙酸11.80 mL,硼酸12.35 g,定容于1 L,取一部分用0.5 mol·L-1氢氧化钠溶液调其pH值。

试剂均为分析纯,水为二次蒸馏水。

1.2试验方法

在10 mL比色管中,依次加入pH 3.5的B-R缓冲溶液2.0 mL,1.0×10-3mol·L-1 BTB溶液0.4 mL,不同浓度的HSA溶液,以不加HSA的相应溶液作参比,用线性扫描二阶导数极谱法测定其峰电流降低值ΔI p″。

2结果与讨论

2.1仪器工作条件的选择

对扫描速度和滴汞静止时间进行了考察,随着扫描速度的增加,ΔI″p值增大,试验发现:扫描速度在800 mV·s-1时,峰形较好,ΔI″p值达到最大,选择800 mV·s-1作为分析扫描速度;静止时间在15 s时,ΔI″p值达到最大,选择15 s作