分子生物学的研究方法-DNA-蛋白质相互作用

的DNA序列的部位及特性的专门的实验技术。
西北师范大学 ---生命科学院<分子生物学>
第五章 分子生物学研究的主要方法
DNasel足迹试验过程
首先是将待检测的双链DNA分子用32P作末端标记，并用限制酶去掉其
中的一个末端，得到只一条链单末端标记的双链DNA分子
体外同细胞蛋白质提取物混合。待二者结合之后，再加入少量的
DNasel（它可沿着靶 DNA作随机单链切割）消化DNA分子，并控制酶的 用量使之达到平均每条链只发生一次磷酸二脂键的断裂。如果蛋白质提取
物中不存在与DNA结合的特异蛋白质，经DNasel消化之后便会产生出距
放射性标记末端1个核苷酸、2个核苷酸、3个核苷酸等一系列前后长度均 仅相差一个核苷酸的、不间断的、连续的DNA片段梯度群体。
甲基化干扰试验不仅可以用来研究蛋白质与G残基之间的联系，而且同 样也可以用来研究DNA结合蛋白质与结合位点中的腺嘌呤A残基之间的 联系作用。头一个办法是使所有的嘌呤残基甲基化，以便同时研究甲基 化的G和A残基对蛋白质与DNA结合的干扰效应。第二种办法是使用焦 碳酸二乙脂（DEPC）特异性修饰A，而使之易受六氢吡啶的切割作用。 对于研究诸如像具有相对少数G残基的八聚体基序（例如 OCt－1，OCt
使用竞争 DNA，可间接阐明体内的 DNA 与蛋白质的相互作用。如，使用 一种具有与已知转录因子结合位点的竞争DNA，就可以判断检测到的蛋白 质是否属于此类转录因子，或是与之相关的其它转录因子；如果事先引入 突变，可以检测突变对其与转录因子结合作用的影响。
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第五章 分子生物学研究的主要方法
凝胶阻滞试验用途
鉴定特殊细胞提取物中，是否存在可同放射性标记的探针DNA结合的蛋白 质分子（比如特异的转录因子等）
研究发生此种结合作用之精确的 DNA 序列的特异性：其办法是在 DNA 一 蛋白质结合反应体系中，加入超量的非标记竞争DNA。如果竞争同一种蛋 白，由于竞争 DNA 与探针 DNA 相比是极大超量的，绝大部分蛋白质都会 被其竞争结合掉而使探针DNA处于自由状态，自显影图片上不出现阻滞的 条带，相反，如果不竞争同一蛋白，探针DNA仍与特定蛋白复合，呈现阻 滞的条带。
－2等，它们可与八聚体结合蛋白质结合）这样的序列而言，这些甲基化
干扰试验技术具有特别的价值，因为只要研究G残基的甲基化干扰，就 可获得有用的信息。
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第五章 分子生物学研究的主要方法
DMS化学干扰的主要局限性
它只能使G和A残基甲基化，而不能使T和C残基甲基化。尽管 如此，它仍不愧为足迹试验的一种有效的补充手段，可以鉴定 足迹区段中DNA与蛋白质相互作用的精确位置。
第五章 分子生物学研究的主要方法
体内足迹试验优缺点
显而易见，与应用克隆DNA片段所作的体外足迹试验的结果相比，经 体内足迹试验从染色质总DNA中所获得的任何一种特异DNA的数量， 都是微不足道的。因此，有必要通过PCR扩增特异的靶DNA，以获得 足够数量的DNA样品。如今体内足迹试验已发展成为研究在完整的活 细胞内，DNA一蛋白质结合位点及检测结合位点中碱基突变效应的一 种极有效的手段。
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DNasel足迹试验发展
目前还出了若干种其它类型的足迹试验。例如，自由羟基足迹试验及
菲咯琳铜足迹试验等。其中最有趣的是硫酸二甲脂（DMS）足迹试验。
它所依据的原理是，DMS能够促进DNA中裸露的G甲基化，而六氢吡啶 又会对甲基化的G残基作特异的化学切割。假如有一种蛋白质同DNA分 子中的某一区段结合，在它的保护下，区域内的G免受六氢吡啶的切割， 于是在DNA片段的序列梯中，便不存在具这些G残基末端的DNA片段， 故出现个空白区域，此即通常所说的足迹。 与其它足迹试验不同，由于DMS足迹试验中被切割的是G残基，因此 可用来鉴定同转录因子蛋白质结合的DNA区段中的特异碱基。
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第五章 分子生物学研究的主要方法
2.6.2 DNasel足迹试验
尽管凝胶阻滞试验能够揭示出在体内发生的 DNA蛋白质之间 相互作用的有关信息，然而它却无法确定两者结合的准确部 位 。 要 解 答 这 个 问 题 ， 则 需 要 应 用 DNasel 足 迹 试 验 （footprinting assay）。它是一类用于检测与特定蛋白质结合
DMS甲基化，因而也就不会被六氢吡啶所切割。因此，同对照的体外裸露
DNA所形成的序列梯比较，就会发现由完整的活细胞染色质DNA形成的序 列梯中，缺少了G残基没有被切割的相应条带（图2－45）。
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第六节
原理
研究DNA与蛋白质相互作用的方法
2.6.1 凝胶阻滞试验
又叫做DNA迁移率变动试验，是80年代初出现的用于在体外研究 DNA与 蛋白质相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术。简单、快捷，是当前被选 作分离纯化特定DNA结合蛋白质的一种典型的实验方法。 在凝胶电泳中，由于电场的作用，裸露的 DNA朝正电极移动的距离是同 其分子量的对数成反比，如果DNA分子结合上一种蛋白质，那么由于分 子量加大，在凝胶中的迁移作用便会受到阻滞，朝正电极移动的距离也 就相在缩短了。所以当特定的 DNA片段同细胞提取物混合之后，若其在 凝胶电泳中的移动距离变小了，这就说明它已同提取物中的某种特殊蛋 白质分子发生了结合作用。
非是体外DMS足迹试验的一个变种而已。
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体内足迹试验的方法
用有限数量的化学试剂DMS处理完整的游离细胞，并使其渗透到细胞内的
浓度恰好导致天然染色质DNA中的G残基发生甲多化。而后从这些细胞中
提取DNA，并加入六氢吡啶作体外消化。结果情况就如同体外足迹试验一 样，能同某种特殊蛋白质因子结合的DNA区段，其上的G残基就不会被
DNA一蛋白质复合物，由于凝胶阻滞的缘故，其特有的放射性标记的探针
DNA条带就将滞后出现在较靠近凝胶顶部的位置。所以有的文献中也称这 种试验为条带阻滞试验（band retardation assay）。
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从此混合物中除去蛋白质之后，将DNA片段群体加样在变性的DNA
测序凝胶中进行电泳分离，经放射自显影，便可显现出相应于DNasel
切割产生的不同长度DNA片段组成的序列梯度条带。但是，如果有一 种蛋白质已经结合到DNA分子的某一特定区段上，那么它就将保护这 一区段的DNA免受DNasel的消化作用，因而也就不可能产生出相应长 度的切割条带。所以在电泳凝胶的放射自显影图片上，相应于蛋白质 结合的部位是没有放射标记条带的，出现了一个空白的区域，人们形 象地称之为“足迹” 。
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思考题
1、研究DNA与蛋白质相互作用的方法有哪些？ 2、凝胶阻滞试验原理是什么？ 3、用图示的方法说明DNasel足迹试验的过程。 4、甲基化干扰试验有什么用途？ 5、什么是体内足迹试验？
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2.6.4 体内足迹试验
上面所讨论的这三种方法有一个共同的不足之处，即它们都是在体外进 行的试验。因此人们自然会问，这些结果能够确切地反映活细胞内发生 的DNA 一蛋白质相互作用的真实情况吗？为了解答这个问题，科学工作 者又设计出了一种体内足迹试验体系。然而究其实质而言，这种技术无
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2.6.3 甲基化干扰试验
应用甲基化干扰试验（methvlation interference assay）技术， 可以检测靶DNA中特异G残基的优先甲基化对尔后的蛋白质结
合作用究竟会有什么效应，从而更加详细地揭示 DNA 与蛋白
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第五章 分子生物学研究的主要方法
应用凝胶阻滞试验、DNasel足迹试验、甲基化干扰试验，以及体内足迹 试验等多种用于研究DNA与蛋白质相互作用的基本实验手段，将有助于 深入地探讨基因启动子元件的结构与功能，及其与蛋白质转录因子之间 相互作用的有关细节；揭示mRNA转录超始和终止的分子本质与主要步 骤；阐明在发育过程中基因表达调节的时空特异性；以及外源基因在转 基因植株中表达的分子机理，等等。这些研究结果，将为我们提供大量 重要的信息，以最终弄清基因表达调节的真实内容。
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第五章 分子生物学研究的主要方法
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第五章 分子生物学研究的主要方法
足迹试验的优点
可以形象地展示出一种特殊的蛋白质因子同特定DNA片段 之间的结合区域。如果使用较大的DNA片段，通过足迹试 验便可确定其中不同的核苷酸序列与不同蛋白质因子之间 的结合位点的分布状况。如同凝胶阻滞试验一样，也可以 加入非标记竞争DNA，来消除特定的足迹，据此确定其核 酸序列的特异性。
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凝胶阻滞试验方法
首先是用放射性同位素标记待检测的DNA片段（亦称探针DNA），然后同 细胞蛋白质提取物一道温育，于是便有可能形成DNA一蛋白质复合物。将 它加样到非变性的凝胶中，在控制使蛋白质仍与DNA保持结合状态的条件 下进行电泳分离，并应用放射自显影技术显现具放射性标记的DNA条带位 置。如果细胞层白质提取物中不存在可同放射性标记的探针DNA结合的蛋 白质，那么所有放射性标己都将集中出现在凝胶的底部；反之，将会形成
不起作用，那么六氢吡啶对这个G残基的切割作用，则在同蛋白质结合的
DNA分子及不同蛋白质结合的DNA分子中均可观察到（图2－44）
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Байду номын сангаас甲基化干扰试验的用途
质之间相互作用的模式。
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甲基化干扰试验的具体操作
先用硫酸二甲脂（DMS）处理靶DNA，控制反应条件，使平均每条DNA分
子只有一个G甲基化，而后将这些局部甲基化的DNA群体同含有DNA结合
蛋白的适当的细胞提取物一道温育，并作凝胶阻滞试验。经电泳分离之后， 从凝胶中切取出具有结合蛋白质的DNA条带和没有结合蛋白质的DNA条带， 并用六氢吡啶处理之，于是甲基化的G残基被切割，非甲基化的G残基则不 被切割。显而易见，如果某个G因甲基化而不与蛋白质结合，那么六氢吡 啶对这个甲基化G残基的切割作用，就只能在没有同蛋白质结合的DNA分 子上表现出来。相反地，如果一个特殊的G残基在DNA与蛋白质的结合中