分子生物前沿技术之蛋白质组学

分子生物学前沿技术之蛋白质组学

蛋白质是体现生命体生理功能最重要的物质，它作为生命体的一种表型存在。生物体在不同的发育阶段会合成类型数量不同的蛋白质，而这些动态变化的蛋白质构成了细胞某一时刻的特征性生命活动的基础，是认识生命活动本质的一个恰当而直接的途径。随着研究蛋白质组学研究技术的发展，蛋白质组逐渐成为分子生物学前沿课题之一。

1蛋白质组学的概念

蛋白质组( Proteom e)的概念是澳大利亚Macquaire大学的一个博士后MarcWilkins于1994年首先提出, 蛋白质组一词来源于蛋白质与基因组2个词的组合，定义为一个基因组所表达的蛋白质。即生物物种、个体、器官、组织、细胞乃至体液等在特定的环境条件下，特定时刻的全部蛋白质的表达图谱。这一概念很快得到国际生物学界的一致认可，同时他们也提出了蛋白质组学的概念，即在大规模水平上研究蛋白质的特征，包括蛋白质的表达水平，翻译后的修饰，蛋白与蛋白相互作用等，由此获得蛋白质水平上的关于疾病发生，细胞代谢等过程的整体而全面的认识。蛋白质组是一个动态的概念，它不仅在同一个有机体的不同组织和不同细胞内不同；在同一个生物体的不同发育阶段，直至最后消亡的全部过程也在不断变化。生物体处于不同生理状态下不同，在不同外界环境下也是不同的。也正是通过这种复杂的基因表达模式体现了各种复杂的生命活动。事实上每一种生命活动都是特定的蛋白质群体在不同时间和空间发挥功能的结果。蛋白质组学研究的开展是生命科学进入后基因组学时代的重要的里程碑。

近年来，随着拟南芥(Arabidopsis thaliana)、水稻(Oryzasativa)和杨树(Populus trichocarpa)等植物全基因组序列测定的完成和基因组学研究的深入，植物蛋白质组学研究已成为时代的热点之一。目前一些新方法和实验技术体系如cDNA微阵列、DNA芯片、基因表达系统分析和基因敲除均能有效分析大量基因的表达和功能模式，并取得了很大进展。但是基因功能的实现最终是以蛋白质的形式体现的，而蛋白质有其自身特有的活动规律，在转录水平上所获取的基因表达信息并不足以揭示在细胞内的确切功能。因此，需要对蛋白质的表达模式和功能模式进行直接分析。在此背景下，植物蛋白质组学应运而生，成为生物学领域研究的热点。

虽然与人类和酵母蛋白质组学相比，植物蛋白质组学起步较晚，但是植物蛋白质组学发展迅速。近年来，以水稻和拟南芥等模式植物为代表的多种植物组织(器官)的蛋白质表达谱分析相继完成，并且植物发育和生殖过程中不同阶段的蛋白质组变化，以及此过程中植物响应各种环境因子的差异表达蛋白质组也被大量报道。

2 蛋白质组学的相关技术

由于基因表达的选择性剪切, 翻译后修饰和蛋白剪接，遗传信息的表达模式不再是一个基因对应一个蛋白的经典模式，大多数基因可以编码的蛋白数大于1。因此，与基因组计划相比，蛋白质组研究的高度复杂性使其面临更多的挑战，研究的工作量和投入将更大，也更需要高通量、高精确度和高分辨率的大规模研究方法的支持。到目前为止，蛋白质组的研究仍然主要依托于以双向凝胶电泳为主的蛋白质分离技术、以质谱为基础的蛋白质鉴定技术和生物信息学及蛋白质组信息学的迅速发展。

2.1双向凝胶电泳技术

双向电泳技术是蛋白质组学研究工作中最为有效的工具之一。双向电泳是指利用蛋白质的带电性和分子量大小的差异，通过两次凝胶电泳达到分离蛋白质群的技术。双向电泳技术

依据两个不同的物理化学原理分离蛋白质。第一向电泳依据蛋白质的等电点不同，通过等电聚焦将带不同净电荷的蛋白质进行分离。在此基础上进行第二向的SDS聚丙烯酞胺凝胶电泳，它依据蛋白质分子量的不同将之分离。双向电泳技术包括蛋白样品制备、等电聚焦、SDS一PAGE电泳等，主要技术线路流程：蛋白样品制备——干胶条水合——等电聚焦——聚焦——后胶条平衡——SDS一PAGE电泳——凝胶染色——图像扫描。

2.2 质谱技术

20世纪80年代末，2种崭新的质谱技术：软离子技术ESI(电喷雾电离)和MALDI (基质辅助激光解吸电离)的出现在技术上使蛋白质组学的产生和发展成为可能。并且成为现代蛋白质科学研究中不可缺少的组成部分。MALDITOF-MS(基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱) 和电喷雾电离串联质谱( ESI- MS /MS)取代了速度较慢、灵敏度较差的Edman化学降解法，实现了蛋白质组学上的高通量。现在用于鉴定蛋白质的生物质谱技术主要包括肽指纹的测定和运用串连质谱进行的肽序列分析。肽指纹图谱的测定是对二维胶分离的蛋白质点进行酶解，对所得的肽混合物进行质谱分析，通常采用的是MALDI- TOF- MS，然后通过与蛋白质数据库中的蛋白质的理论肽质量相比较来鉴定蛋白质。肽序列分析通常运用串联质谱方法从一级蛋白质图谱中选择特定荷质比的离子，并对其进行碰撞诱导解离，根据肽段的断裂规律导出肽序列。

2.3 高效液相色谱

近年来，高效液相色谱已成功应用于蛋白质组学中，它主要与高通量的质谱仪联用，构成自动化的液质联机。具有分析速度快、分离效率高和检出极限低的特点。它的分离原理与双向电泳相似，先根据蛋白质的大小用排阻色谱（正相柱）分离蛋白质，馏分自动进入反相液相色谱（反相柱），便得到了二维色谱图。然后将分析物移至96空板上，进而自动加到MALDI-TOF-MS靶上进行鉴定。

2.4 蛋白质芯片

近年来,美国Ciphergen公司发明了SELDI蛋白芯片技术, 它将蛋白质分离与质谱分析集于一体, 实现了一步分离与鉴定。SELDI芯片技术是利用系统设计的具有不同化学表面修饰的芯片, 使之能选择性地富集一组蛋白质, 在添加能量吸收分子以后，送入阅读机, 以MALDI飞行时间质谱检测和测定被富集到8一24个样品点上的所有蛋白质。蛋白质芯片系统通过测定蛋白质分子的飞行时间, 检测并且迅速计算出蛋白质的分子量。

2.5 相互作用蛋白质组

细胞内蛋白质的分布不是无序的，蛋白质与蛋白质之间存在相互作用，这种作用不仅表现在蛋白质之间的物理互作，而且也体现功能互作。研究蛋白质间的相互作用的方法有酵母双杂交系统、串联亲和纯化、免疫沉淀、蛋白质交联等，其中酵母双杂交系统和串联亲和纯化是目前发展迅速、应用广泛的高通量检测蛋白与蛋白互作的主要方法。

2.6 生物信息学技术

蛋白质组学能够得以迅速发展很大程度上要归功于计算机技术和生物信息学技术的发展。生物信息学识生物科学与计算机科学以及应用数学学科相互交叉而形成的一门新兴学科。它通过对生物学实验数据的获取、加工、存储、检索和分析，达到解释数据所蕴含的生物学意义的目的。以核酸、蛋白质等生物大分子数据库为主要对象，以数学、信息学、计算机科学为主要手段，以计算机硬件、软件和计算机网络为主要工具，对大量的原始数据进行