高密度细胞库建立和灌注培养

一种新的细胞扩大方法

使用高密度细胞库，一次性生物反应器和灌注技术

by Benjamin Wright, Mike Bruninghaus, Mike Vrabel, Jason Walther, Neha Shah, Seul-A Bae,Timothy Johnson, Jin Yin, Weichang Zhou, and Konstantin Konstantinov

一个典型的细胞培养过程从细胞解冻复苏开始，随后通过连续传代培养对细胞进行扩增，可选用的培养设备包括摇瓶、细胞培养转瓶、WAVE波浪袋生物反应器和机械搅拌生物反应器等（1）。当细胞培养体积和细胞密度达到预定标准时，细胞将转入到生物反应器中继续生长并表达产物。这种方法目前还面临着一些挑战。

摇瓶和转瓶是细胞放大培养初期使用的主要设备，这两种设备都需要在超净工作台中手动操作，这种情况下容易出现污染，而且易受操作者失误影响。此外，传统的细胞库保存细胞时，冻存管内细胞数量较少，细胞在放大过程中耗时较长。生产用生物反应器体积非常大，需要许多中间型号的培养设备来将种子细胞按比例放大，这将导致需要更长的放大培养时间，并使情况变得更加复杂。生物反应器接种活细胞密度通常低于× 106cell/mL,接种细胞后需要培养生长5-10天。在细胞生长期内，由于细胞密度达不到标准不能表达产物或产物含量低，这段时间不能产生实用价值。

有研究表明，建立高密度细胞库可以减少细胞放大的步骤并提高细胞放大成功率。Tao et al.等人建立了高密度细胞库，每冻存管中活细胞量达到× 108个，细胞复苏后直接接种到20L的WAVE 波浪袋生物反应器中（2）。这项研究表明，使用高密度细胞库可以减少中间摇瓶放大步骤并且节约9天的细胞扩大培养时间。Heidemann et al. 等人使用高密度细胞库配合几种不同大小的一次性生物反应器对细胞进行放大培养，减少了60–70%的培养时间（3）。

一次性生物反应器相比不锈钢生物反应器具有许多优点，例如灵活性大大增强，节省安装、清洗和灭菌时间，减少资本投资等（4-6）.GE公司的一次性WAVE波浪生物反应器常常用于种子细胞的扩大培养，该种反应器可以大大减少污染风险（通常不需要在层流罩下工作），而且不需要安装、清洗和灭菌等操作（7）。

目前工业化生产中，细胞灌注培养越来越受到人们关注。一些公司已经成功的将细胞灌注培

养用于商业化生产中（9）。使用灌注培养可以在较小体积的生物反应器中获得高的细胞密度（10），相比批次培养和流加培养能更快的收获培养中的不稳定产物（11）。由于这些和其他特点，灌注培养常常在最终生产产品的生物反应器上使用，而不在细胞扩大过程中使用。

Whitaker (12) and Heidemann (3)简单提及过灌注培养在细胞扩大过程中的应用，但他们没有讨论灌注培养在改进终端细胞种扩大、减小生物反应器大小、减少生物反应器培养步骤和减少细胞在生产用生物反应器中细胞生长阶段时间等方面的潜力。Pohlscheidt (13) 使用了一台带有倾斜细胞沉降装置的3000L生物反应器进行细胞灌注培养，细胞密度达到× 106个/mL, 相比流加培养减少了20%的培养时间。然而，由于细胞分离器对流加速率的限制，细胞长期在次优的条件下生长，想要进一步提高细胞密度变得相当困难（10）。

在这里，我们描述了一种新的细胞扩大方法，该方法需要使用到高密度细胞库、一次性波浪生物反应器和交替切向流（ATF）灌注培养技术。图1中比较了一个用常规方法将细胞扩大到500L生产用生物反应器（n）中的例子。使用高密度细胞库方法减少了中间两个转瓶培养的步骤，可以直接接种到2L的波浪生物反应器中。使用波浪生物反应器（2L和20L）代替转瓶（125ml到10L）大大减少了需要在超净台中操作的次数。这种替换使整个过程在一个封闭系统中进行，提高了操作成功率。ATF 灌注培养技术在n-1级生物反应器（图中为带有ATF灌注装置的50L生物反应器）的应用能使细胞密度大于50×106个/ml。这种细胞扩大方式将使得500L生物反应器接种细胞密度达到5×106个/ml，远远超过常规培养时的接种密度×106个/ml。更高的接种细胞密度可以为500L生物反应器减少5天细胞生长时间，可以为500L生物反应器生产线节省50天操作时间。

材料和方法

细胞系和培养基：市场可买到的确定组分培养基 (Life Technologies)，添加4毫摩尔谷氨酰胺(Sigma-Aldrich)。中国仓鼠卵巢细胞系(Genzyme公司专利，能生产一种人类重组蛋白酶)

在2L和20L波浪袋生物反应器中扩大细胞: 我们解冻一支高密度细胞冻存管(10×107个活细胞/ml, 支) 直接接种2L波浪袋生物反应器 (GE Healthcare Life Sciences)，工作体积为1L。当细胞密度达到×106个/mL时，我们将细胞扩大到20L波浪袋生物反应器中培养，工作体积为。一个20/50 EHTD Wave生物反应器系统(GE Healthcare Life Sciences) 作为2L和20L生物反应器摇摆平台，控制培养

温度37°C,摇晃速度16rpm，摇晃角度7°， 20% 的O

2和 5% 的CO

2

混合气体以 slpm的速度进入顶部

空间。

种细胞n-1反应器灌注培养: 我们使用了一台15 L玻璃生物反应器(Broadley-James Corporation)，配备了ATF4灌流装置来模仿n- 1细胞种扩大阶段(图1中的50L生物反应器)。一个20um的微孔进气管

水平< 120mmHg压力。加氧气，控制溶解氧(DO)在40 %；一个1mm孔径的进气管加氮气，控制溶解的co

2

根据需要，我们添加了碳酸钠以保持Ph > ,添加10 %消泡剂(Life Technologies)控制泡沫水平。

我们使用一台15L的生物反应器进行细胞培养，工作体积为10L，接种细胞密度×106个/ml，批次培养两天后开始灌注培养。在开始，使用一个活细胞浓度在线分析电极(Aber Instruments)和可编程逻辑控制程序(Emerson Process Management)控制灌注速率为 nL/cell/day。当活细胞浓度达到20×106个/ml时，限制灌注速率为每天4个工作体积。

50ml转管批次换液培养模型评价接种不同细胞密度：当n-1级种子反应器中细胞密度达到25×106、50×106、100×106个/ml时分别取样，接种到50ml转管（TPP Techno Plastic Products）中，接种密度为×106、×106、×106个/ml三种不同密度类型，工作体积为10ml，每个培养管做3份平行样。由于转管不能做灌注，采取每天换液的方式培养。从第一天开始给转管更换培养基，更换方法是将转管从培养箱拿出后用1100rpm离心5min，弃上清，加入新鲜培养基重悬细胞。这种换液策略能够保证接种不同浓度细胞的转管具有相同的换液速率。转管在高频脉冲恒温摇床（HT Infors）中培养，培养条件为37°C，摇晃频率160rpm，角度45°，相对湿度80%， CO2浓度5%。