分子病理学技术讲稿

（６）其它：ＡＣＴＨ、Calcitotin、Gastrin、Glucagon、hGH、 Insulin 、Serotonin等。

免疫组织化学最突出的优点： 能在原位确定组织及细胞结构的化学成
分。
深入---------原位分子杂交和免疫电镜。
电子显微镜技术

电子显微镜（electron microsocope）简称电镜，
9．神经及神经内分泌肿瘤及其标记物：
（１）胶质纤维酸性蛋白（Glial fibrillary acidic protein, ＧＦＡ Ｐ）：胶质细胞、室管膜细胞； （２）髓鞘碱性蛋白（ＭＢＰ）：少突胶质细胞； （３）神经细胞烯醇化酶（ Neurun specific enolosa,ＮＳＥ）： 神经细胞； （４）神经微丝（Neurofilaments,ＮＦ）神经细胞、嗜铬细胞、 副节细胞、ＡＰＵＤ瘤； （５）嗜铬素Ａ（Chromogranin Ａ）：神经内分泌肿瘤。
细胞内的病毒颗粒等。
肿瘤鉴别诊断 病毒包涵体 肾炎的分型
二．扫描电镜
扫描电子显微镜就是用聚得很细的电子束流照射要检测的样品表面。
由于电子束与样品的相互作用产生各种信息然后通过不同的检测器接收
相应的信息，经过处理后显示出样品的各种特征。 扫描电镜具有以下特点：能够直接观察样品的表面的结构；样品制备
过程简单，不用切成超薄切片；可以从各种角度对样品进行观察；景深
四．免疫组织化学染色过程中需注意的有关事项
１．正确设置免疫组织化学的对照
对照原则：首先对照第一抗体；替代对照要注意相同的原 则；阳性结果阴性对照，阴性结果阳性对照；染色清晰， 定位准确。 阴性对照：
（１）空白对照：用ＰＢＳ置换第一抗体； （２）血清替代对照：用同种动物的正常血清代替第一抗体； 阳性对照：用已知或已被实验证明为阳性的组织； 自身对照：利用组织切片内的各种不同的组织成分作对照。
（３）选择性存在于某些上皮细胞内的标记物： ① 癌胚抗原（ＣＥＡ）；
② 甲胎蛋白（ＡＦＰ）；
③ 前列腺特异性抗原（ＰＳＡ）及激素类等。
2．间叶组织（软组织）及其肿瘤标记物：
（１）间叶源性肿瘤：波形蛋白（Vimentin）；
（２）纤维组织源性肿瘤：纤维瘤、肉瘤，恶纤组。 ① 抗胰蛋白酶（α1—ＡＴ，ＡＡＴ）； ② 抗胰糜蛋白酶（α—ＡＣＴ，ＡＣＴ）； ③ 溶菌酶（Lysozyme）。
临床病理技术 ------免疫与分子病理技术
首都医科大学临床病理中心
冯骥良
病理学的进步是病理技术的进步
器官病理学
细胞病理学
超微病理学 免疫病理学 分子病理学 远程病理学
大
细
体
胞
超微结构 分子基因

病理学技术包括： 传统病理学技术 和 现代新技术
人体病理学技术
和
实验病理学技术
一
免疫组织化学与免疫细胞化学
⑵ Lysozyme少数阳性。
６．滑膜及间皮肿瘤及其标记物：双向分 化，无特异性标记物。
Keratin,EMA;Vimentin,FN,AAT,ACT,Lysoz
yme等均有可能阳性。
７．周围神经肿瘤及其标记物：
⑴ S-100：神经纤维肿瘤，神经鞘肿瘤。
⑵ 髓性碱性蛋白（Myelin basic protein,MBA）； ⑶ 髓鞘相关蛋白（MAG）；
4．抗体标记组织切片；
5．染色反应； 6．观察结果。
常用的抗体标记物 ：
1．酶 为最常用的标记物。作为标记的酶应具有以下条件：① 底物是特异性的，且易于显示；②酶反应产物稳定，不易 扩散；③容易获得纯酶分子且较稳定；④酶标记抗体后， 不影响两者的活性；⑤被检组织中不应存在内源性相同的 酶或其底物。常用的标记酶有辣根过氧化物酶（HRP）、 硷性磷酸酶（AKP）、葡萄糖氧化酶（GOD）等。 2．荧光素 指在高能量光波的激发下能产生荧光的物质。常用 的有异硫氰酸荧光素（FITC）、四甲基异硫氰酸罗达明 （TRITC）。 3．生物素 其与卵白素的亲和力明显高于抗原抗体的结合力。 4．金属标记物 如铁蛋白和胶体金。多用于免疫电镜。
2．假阳性反应：
⑴ 非特异性反应：边缘现象、皱折和刀痕、出血和坏死等； ⑵ 内源性过氧化物酶：红细胞、炎细胞、退变坏死细胞和 某些腺上皮分泌物，以及某些富含过氧化物酶的组织， 如脑、肝等； ⑶ 抗体的交叉反应：抗体本身含有与人体组织发生交叉反
应的成分；
⑷ 试剂浓度过高或失效。
3．假阴性反应：
⑴ 组织固定不当或固定时间Biblioteka Baidu长； ⑵ 抗体效价过低或久置失效； ⑶ 组织中抗原被粘稠基质或分泌物阻隔；
（三）PAP法与双PAP法：
既 过 氧 化 物 酶 抗 过 氧 化 物 酶 复 合 物 法 (Perixidase Antiperoxidase Complex Method,PAP) 先将过氧化物酶（HRP）免疫兔/羊/鼠，制成兔/羊/鼠抗 ＨＲＰ；然后再与ＨＲＰ结合，形成一个稳定的多角形结 构（PAP）。 特点：⑴ 敏感性较高；

合格的超薄切片样品应该达到以下基本要求： （1）切片的厚度应在50nm左右，不能超过 100nm，以获得较高的分辨率和较高的反差； （2）切片应能耐受电子束的强烈照射而不发 生破裂、变形；（3）细胞超微结构保持良好， 没有明显的物质凝聚和丢失。

电子显微镜技术： 细胞内的细胞器、细胞骨架或大分子水平的变化。
3．肌细胞及肌上皮肿瘤及其标记物：肌瘤、肌肉瘤、
肌上皮瘤。
⑴ 结蛋白（Desmin），最常用，肌细胞分化最早的标记； ⑵ 肌动蛋白（Actin），属肌丝蛋白，６种亚型分别存在于不同的 肌细胞、肌上皮细胞 ⑶ 肌球蛋白（Myosin），属肌丝蛋白，分Ⅰ型（慢）和Ⅱ型（快） 收缩纤维，存在于心肌、横纹肌及平滑肌中，肌动蛋白和肌球 蛋白均出现在肌细胞发育分化中期。 ⑷ 肌红蛋白（Myoglobin），是心肌和横纹肌结合氧的肌红蛋白， 存在于分化成熟的横纹肌中。

超薄切片术（techniques of ultrathin section）是 最基本的电镜样品制备技术，其基本过程同石蜡 切片大体相似，包括取材、固定、漂洗、脱水、
渗透与聚合、切片和染色等多个环节，但操作过
程比石蜡切片更为细致与复杂。为了获得理想的
超薄切片，操作者必须认真对待每一步骤，任何
环节的疏忽都可能导致制样的失败。
４．内皮细胞肿瘤及其标记物：血管内皮肉瘤
⑴ 第Ⅷ因子相关抗原（Factor Ⅷ-related Antigen,Ｆ８）
⑵ 荆豆凝集素（Ulex Europaeus－1 Lectin,ＵＥＡ－１）；
⑶ ＢＭＡ２００、ＣＤ３１、ＣＤ３４等。
５．骨、软骨和脂肪组织肿瘤及其标记物： ⑴ Ｓ－１００，Vimentin阳性；
大，图像富有立体感；图像的放大范围广，分辨率也比较高；电子束对 样品的损伤与污染程度较小；在观察形貌的同时，还可利用从样品发出
的其他信号作微区成分分析。

扫描电镜： 血管破裂
扫描电镜：小肠微绒毛
第五节 生物芯片技术

生物芯片技术（biochip technology）是将大量具有生物识
别功能的分子或生物样品有序地点阵排列在支持物上并与 标记的检体分子同时反应或杂交，通过放射自显影、荧光 扫描、化学发光或酶标显示可获得大量有用的生物信息的 新技术。生物芯片技术包括基因芯片、蛋白质芯片、细胞 芯片、组织芯片、以及元件型微阵列芯片、通道型微阵列 芯片、生物传感芯片等新型生物芯片。可对DNA、RNA、 多肽、蛋白质、细胞、组织以及其它生物成分进行高效快
图 白藜芦醇处理Jurkat细胞超微结构
一．透射式电镜

主要用于观察细胞内部的微细结构，由于电子
的穿透力较弱，故用于透射电镜观察的标本必
须切成50~100nm的超薄切片。换句话说，一
个细胞要被切成100~200个薄片才适于在透射 电镜下观察。样品在被超薄切片之前，一般要 经过固定、脱水和包埋等处理，在切片之后还 要经过染色等处理才能进行观察。
是以电子束为照明源，通过电子流对生物样品的 透射以及电磁透镜的多级放大后的荧光屏上成像
的大型精密仪器。按工作原理和用途的不同可分
为透射式电镜（transmission electron microscope,
TEM）和扫描式电镜（scanning electron
microscope, SEM）二种基本类型。
助识别肿瘤的良恶性。
（二）各种不同组织及其肿瘤常见的标记物：
1．上皮组织及其肿瘤标记物： （１）存在于所有上皮细胞内的标记物：
细胞角蛋白（Cytokeratin,ＣＫ）：一种中间丝蛋白
（２）存在于大部分上皮细胞内的标记物： ① 角蛋白多肽（如ＣＫ１９）；
②上皮细胞膜抗原（epithelial membrane antigen,ＥＭＡ）。
⑷ DAB或H2O2的浓度不当。
五、免疫组织化学在肿瘤诊断和鉴别诊断中的应用
（一）在肿瘤诊断中应用免疫组织化学染色的原因：
１在常规病理活检中,通常有５～１０％的疑难病例不能明 确诊断。 ２形态结构相似的肿瘤可为不同的组织来源（如未分化癌和 恶性淋巴瘤）因而难于识别，给治疗带来困难。 ３一些转移性肿瘤常常缺乏特有的组织学特征，因而无法确 定其原发病灶（如甲状腺癌和前列腺癌）。 ４通过一些反映细胞增殖和与肿瘤恶性程度有关的标记物协
原理与方法
免 疫 组 织 与 细 胞 化 学 （ Immunohistochemistry and
immunocytochemistry）： 是在单克隆抗体技术产生后，利用免疫学原理，将抗原抗体反 最后用辣根过氧化物酶显色。从而定位组织细胞中抗原（蛋 白 多肽、酶）等多种基因产物的特异方法。 在病理学外检工作中可用于对不同来源，HE难以诊断的 的肿瘤进行确诊和鉴别诊断。
应应用与组织细胞化学而进一步通过级连放大，增加敏感性。
基本原理：形成“抗原－抗体复合物”。
图1： CK19阳性的BEL-7402细胞
图2：OV-6阳性的HepG2细胞
肌动蛋白
雄激素受体
CD3-T细胞
雌激素受体（ER）
免疫组织化学技术的主要步骤：
1．提取抗原(免疫原Immunogen); 2．用免疫原免疫动物(兔)制备抗血清(多克隆抗体) 或 免疫动物(鼠)后，用杂交瘤技术制备单克隆抗体； 3．纯化抗体；
⑷ 层粘连蛋白（Laminin）。
8．淋巴造血组织肿瘤及其标记物：
(１)LCA（Leucocyte Common Antigen，白细胞共同抗原）；
(２)CD19，CD25，CD20－－标记Ｂ淋巴细胞；
(３)CD4，CD8，CD3－－标记Ｔ淋巴细胞；
(４)ＭＡＣ３８７、Ｌｙｓｏｚｙｍｅ－－标记组织细胞； (５)ＣＤ１５、ＣＤ３０（Ki-antigen）－－标记Ｒ－Ｓ细胞； (６)CD11，CD14－－标记单核细胞、粒细胞。
三．常用免疫组织化学染色方法
（一）直接法

将荧光素(免疫荧光法)或酶直接标记在第一 抗体上，以检查相应的抗原。直接法具有 特异性强的优点，但敏感性差，耗费抗体 多。
（二）间接法
先用荧光素或酶标记第二抗体，一抗为特异 性抗体， 二抗仅有种族特异性。 特点: ⑴ 预先标好二抗，较方便； ⑵ 比直接法敏感，但仍差。
⑵ 背景染色低（相对）；
⑶ 双PAP敏感性更高，但背景相对较重。
（四）ABC法：
既卵白素－生物素过氧化物酶复合物法(Avidin Biotin-peroxidase Complex,ABC) 利用卵白素与生物素特有的高度亲和力，先将生物素与酶结合形成生物素 化HRP，再以生物素化HRP与卵白素按一定比例混合，形成一个复合物； 同时先将二抗生物素化。 １．如将卵白素换成链霉亲和素，则为： ＳＡＢＣ法：(StreptAvidin Biotin-peroxidase Complex) ２．将链霉亲和素和生物素先连结起来，则称： ＬＳＡＢ法：labelled StreptAvidin-Biotin ３．用链霉素抗生物素蛋白连结辣根过氧化物酶，则为： Ｓ－Ｐ法：(StreptAvidin Peroxidase conjugataed method) 若用碱性磷酸酶标记链霉卵白素则称ＳＡＰ法。 若分别用碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶标记链霉卵白素，则称ＤＳ法 特点: ⑴ 敏感性高，（比ＰＡＰ高８～４０倍）； ⑵ 背景淡，链霉亲和素更好； ⑶ 方法较简便，时间较短； ⑷ 应用范围广，也可用于原位杂交和免疫电镜。