乳酸乳球菌N3816发酵培养基的优化研究

乳酸乳球菌N3816发酵培养基的优化研究作者：申秋华

来源：《安徽农学通报》2013年第19期

摘要：以乳酸乳球菌株（Lactococcus lactis subsp. lactis N3816）为出发菌株，通过单因子试验和正交设计方法对该菌株产Nisin发酵培养基进行优化。结果表明：该菌株产Nisin的最适碳源、复合氮源和生长因子分别为：蔗糖0.8%、蛋白胨2.0%、酵母膏1.0%、Tween80

1.5%。

关键词：乳链球菌肽；培养基；效价

中图分类号 TS207 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2013）19-34-03

乳链球菌肽（Nisin）是乳酸乳球菌的某些菌株在代谢过程中合成的一种具有较强抑菌作用的多肽类细菌素。成熟的乳链球菌肽分子含有34个氨基酸残基，分子量约为3 510 Da，分子式为C143H228N42O37S7。乳链球菌肽前分子含有57个氨基酸，前体分子依次经过将部分丝氨酸和苏氨酸酶促转化为脱水氨基酸、链内形成5个硫醚环、细胞质膜移位和断裂去除N端23肽而形成[1-3]。

Nisin对引起食品腐败的绝大部分革兰氏阳性细菌，特别是对产芽孢的细菌如芽孢杆菌、梭状芽孢杆菌有很强的抑制作用。另外，Nisin与某些表面活性剂、螯合剂和络合剂联合使用时还能抑制部分革兰氏阴性菌。因此，与其它乳酸菌产生的细菌素相比，Nisin具有较宽的抑菌谱。Nisin属于天然食品防腐剂的一种，自1951年首次应用于食品保藏以来，Nisin已先后被数10个国家和地区广泛使用。目前，Nisin应用于乳制品、肉制品、罐装食品和蛋白食品等的防腐保鲜中，成为越来越受人们重视的一种安全、高效、无毒、天然的食品防腐剂[4]。

随着Nisin在食品行业中应用的普及，获得产量较高且生产成本较低的Nisin成为工业化应用的前提。为了提高其产量，人们开始研究一些发酵工艺因素对Nisin发酵生产的影响。本文主要是在实验室条件下对乳酸乳球菌N 3816进行研究，通过改变碳源、氮源和添加吐温的方式获得发酵培养基的最优配比。

1 材料与方法

1.1 试验材料 Nisin标准品购于sigma公司。

1.2 菌种乳链菌肽生产菌：乳酸乳球菌（Lactococcus lactis subsp. lactis N 3816），由实验室保藏。效价检测指示菌：藤黄微球菌（Micrococcus luteus），购自中国科学院微生物研究所菌种保藏中心。

1.3 培养基种子培养基：胰蛋白胨1.0g、酵母膏0.3g、葡萄糖0.5g、牛肉膏0.3g、MgSO4·7H2O 0.02g、K2HPO4·3H2O 0.3g、pH6.8，121℃灭菌20min。

发酵培养基：胰蛋白胨1.0g、酵母膏1.0g、蔗糖1.0g、K2HPO4 1.0g、NaCl 0.2、

MgSO4·7H2O 0.02g、pH 7.0，121℃灭菌20min。

检测菌生长培养基：胰蛋白胨0.8g、酵母膏0.5g、葡萄糖0.5g、NaCl 0.5g、

Na2HPO4·12H2O 1.0g、pH 6.8，121℃灭菌20min。

检测效价培养基：胰蛋白胨0.8g、酵母膏0.5g、葡萄糖0.5g、NaCl 0.5g、

Na2HPO4·12H2O 1.0g、Tween80 1.0mL、琼脂1.5g、pH 7.0，121℃灭菌20min。

1.4 试验方法

1.4.1 发酵培养将活化的斜面菌种接种于种子培养基中培养24h，以5%的接种量接入发酵培养基中，30℃培养。实验过程中改变发酵培养基配方，测定发酵液效价。

1.4.2 Nisin标准溶液制备将Nisin标准样品（效价

1×106IU/mL）用浓度为0.02mol/L无菌稀盐酸溶液溶解，配制成浓度为1 000IU/mL的Nisin标准溶液。使用时用0.02mol/L无菌稀盐酸溶液稀释成10IU/mL，25IU/mL，50IU/mL，75IU/mL，100IU/mL，250IU/mL，500IU/mL，1 000IU/mL的标准品溶液。

1.4.3 Nisin效价测定效价检测采用琼脂孔扩散法[5]。

1.4.4 单因子试验碳源种类和浓度优化试验：改变发酵培养基中碳源的种类进行发酵培养，测定效价来确定最适碳源类型；改变最适合碳源浓度进行发酵培养，通过测定效价来确定最适合浓度。

氮源种类与浓度的优化试验：改变发酵培养基中氮源的种类进行发酵培养，测定效价来确定最适氮源类型；改变最适合氮源浓度进行发酵培养，通过测定效价来确定最适合浓度。

Tween80对产Nisin的影响：选取Tween80浓度分别为0.5%、1.0%、1.5%，按上述方法确定适宜的浓度。

1.4.5 正交试验根据单因素试验的结果，对蔗糖、蛋白胨、酵母膏和Tween80用量4个因素，各取3个水平，设计L9（34）正交试验优化乳酸乳球菌N 3816产Nisin的培养基组成。试验因子及水平见表l。

由图2可知，蔗糖浓度过大或过小对Nisin发酵都是不利的，蔗糖浓度在1.0%时对菌体合成Nisin效果最好，为

1 025IU/mL。当蔗糖浓度>1.0%时，菌体合成Nisin有下降趋势，并且浓度越高下降趋势越明显。产生这种现象的原因可能是因为高浓度底物导致渗透压过高，抑制或影响了菌体的正常生长使得Nisin效价受到影响而明显下降[7]。

2.2 氮源对Nisin发酵的影响以发酵培养基为基础，改变发酵培养基中氮源的种类，各种氮源的添加量都为1%，考察不同氮源对发酵的影响。发酵培养24h后测效价，结果见图3。

由图3可见，当氮源为有机氮源时，乳酸乳球菌N3816的生长明显优于无机氮源，复合氮源的发酵效果最好。复合氮源能为菌体生长和Nisin合成提供一个较为合理的有机氮源配比，有利于微生物的生长与合成代谢；同时，多种氮源复配有利于降低培养基成本，对工业化生产也十分有益。

2.3 Tween80对Nisin发酵的影响以发酵培养基为基础，向起始发酵液中分别加入0%、0.50%、1.00%和1.50%（v/v）的Tween80，发酵培养24h后测效价，结果见图4。（下转87页）

图4为不同Tween80添加量对乳酸乳球菌N3816发酵过程中Nisin产量的影响。由图4可知，各浓度的Tween80对Nisin的合成都有促进作用，并且Tween80的浓度越大Nisin产量提高越多。根据文献报道，Tween80对Nisin合成的促进作用主要是通过降低菌种与培养基的表面张力，增加了细胞胞外酶的合成；同时，改善了细胞的膜透性，提高营养物质的吸收和Nisin在胞内的合成。另外也有研究专家学者认为，Tween80的影响是由于其减慢了Nisin失活速率[8-9]。

2.4 正交试验结果与分析采用正交试验，对乳酸乳球菌N3816产Nisin的发酵培养基组成进行了优化，正交试验结果见表2。

3 结论

本研究表明Nisin的生物合成的最佳碳源是蔗糖，胰蛋白胨和酵母膏为其最佳有机氮源组合。经过正交试验方法优化得出乳酸乳球菌N3816发酵产Nisin的最佳发酵条件：蔗糖0.8%、蛋白胨2.0%、酵母膏1.0%、吐温1.5%。在优化条件下经3批发酵培养Nisin的效价最高可达3 580IU/mL。

参考文献

[1]吴琼，李晶，黄海燕.乳酸链球菌与化学防腐剂抑菌效果比较[J].食品研究与开发，1999，20（1）：44-46.

[2]郭本恒.Nisin产品及影响产品活性的因素[J].中围畜产与食品，2000，7（6）：263-265.