吴怡慧-项目二超氧化物歧化酶(SOD)的生产详解

（3）以空白管为参比，在325nm下每隔30s测1次吸光值，连续 记录3min，调节连苯三酚溶液用量，将其自氧化速率控制在 0.068-0.072D/min。经实验测得连苯三酚溶液的用量为6ul
SOD酶检验步骤
二、酶活性的测定
（1）取两支试管时加入PH值为 8.30的50mol/LK2HPO4KH2PO4缓冲溶液1.5ml，在 25+-0.5℃的恒温水浴中保温 10min，加入等体积酶液； （2）取一支加入事先预热好的 25℃连苯三酚溶液，另支空白 试管再加入10mol/LHCl，迅 速摇匀后倒入1cm比色皿中； （3）以空白管为参比，在 325nm下每隔30s测1次吸光值， 连续记录3min，调节酶液体积， 使样液中连苯三酚的氧化速度控 制在0.033-0.037D/min，记 录此时样液体积。 （4）根据公式计算出酶活性。
0.070-供试品溶液速率 0.070 50% 供试品溶液稀释倍数 x 反应液总体积 x x 100% 供试品溶液体积
单位体积活力（u/ml）=
总活力（U）=单位体积活力x原液总体积

酶活力单位意义：在25℃恒温条件下，每毫升反应液中，每分钟 制邻苯酚自氧化率达50%的酶量定义为1个酶活力单位。
SOD酶检验准备

实训准备（材料与仪器）
材料：大蒜蒜瓣 氯仿-乙醇混合液 冷丙酮 磷酸缓冲溶液 （PH7.8、
仪器：一个石英砂研钵 离心管 移液管 玻璃棒 塞离心管 离心机 冷冻离心机
0.05mol/L)
SOD酶的生产工艺流程图
称取5g大蒜 蒜瓣 捣碎 加入磷酸缓 冲溶液15ml (PH7.8 0.05mol/L) 得到SOD酶沉淀 冷冻 干燥
试剂： （1）PH8.30 50mol/L K2PHO4-KH2PO4缓冲溶液： 25℃下 96.5ml 1mol/LK2HPO4与 3.5ml1mol/LKH2PO4混合后 用水稀释至2000ml 仪器： （1）PH计 （2）紫外分光光度计 （3）恒温水浴槽
（4）10ml试管
（2）0.05mol/L连苯三酚溶液： （5）1cm比色皿 称取3.15g连苯三酚用 0.01mol/L盐酸溶液溶解并定 容至500ml （3）10mol/L盐酸溶液
SOD酶检验步骤
一、连苯三酚自养化速率的测定
（1）准备好两只试管，同时加入PH值为8.30的 50mol/LK2HPO4-KH2PO4缓冲溶液4.50ml，在25+-0.5℃的恒温 水浴中保温10min； （2）其中一只试管加入等体积事先预热好的25℃连苯三酚溶液， 另支试管作为空白管，加入等体积10mol/LHCl，迅速摇匀后倒入 1cm比色皿中；
SOD酶检验原理
连苯三酚在碱性条件下，能迅速自氧化，释放出O2-,生成带色 的中间产物（反应液由黄棕色变为绿色，再变为黄色，这是由于生 成的中间物不断氧化的结果）。在自氧化过程的初始阶段，黄色中 间产物的积累在滞后30-45s后就与时间呈现性关系。中间产物在 420nm处有强烈的光吸收，线性时间一般维持4min的范围内。在 有SOD存在时能催化生成O2和H2O2，从而阻止了中间产物的积 累，通过计算就可以求出SOD的活力。 邻苯三酚自养化法测定酶活力，计算公式：


超氧化物歧化酶（SOD）基本知识

概念：超氧物歧化酶（Superoxide Dismutase简称SOD）是一 种新型酶制剂，是广泛存在于生体内各种组织的一种金属酶，是机 体细胞抵御氧化损伤最重要的酶之一，是药用酶之一，被视为生命 科技中最具神奇魔力的酶、人体内的垃圾清道夫。 功能：清除体内多余的自由基；延缓由于自由基侵害而出现的衰 老现象；提高人体抵抗自由基诱发疾病的能力；能抗疲劳、甚至抗 肿瘤体内的SOD活性越高，寿命就越长。 分布： 主要分布
分 离
持续搅拌15min以 6000r/min离心15 min
将沉淀置于5ml磷 酸缓冲溶液中 （PH7.8、 0.05mol/ml）
以6000r/min离心15min 弃沉淀取上清液
加入等体积冷丙酮
得到粗酶液
提 取
再研磨20min 直到充分溶解 置于冷冻离心 机以6000r/min 离心15min

酶是由生物活细胞产生的具有特殊催化功能的一类生物活性物质， 其化学本质是蛋白质，故也称酶蛋白。

用于预防，治疗和诊断疾病的一类酶制剂，称为药用酶。早期主 要用于治疗消化道疾病、烧伤及感染引起的炎症等，现已广泛应 用于多种疾病的治疗。
药用酶制备通常有三种方法：直接提取法；微生物发酵法；动植 物细胞培养法 药用酶常用提取纯化方法有：水溶液法；有机溶剂法；表面活性 剂法（应用较少）
预习方案汇报PPT
项目二超氧化物歧化酶（SOD） 的生产
班级：生物制药1411 姓名：吴怡慧
目 录
1 2
酶与SDO酶的基本知识 酶的生产工艺与准备
Contents
3
4
SOD酶的检验与准备
注意事项
di
yi
zhang
jie
第 一 章 节
1、酶的基本知识
2、超氧化物歧化酶（SOD）基本知识
酶的基本知识
超氧化物歧化酶 (superoxide dismutase，SOD) 是一种具有抗氧化、抗衰老、抗 辐射和消炎作用的药用酶。它可 催化超氧负离子(O2-)进行歧化反 应，生成氧和过氧化氢。大蒜蒜 瓣和悬浮培养的大蒜细胞中含有 有机溶剂沉淀的原理是有 机溶剂能降低水溶液的介电常数， 较丰富的SOD，通过组织或细胞 使蛋白质分子之间的静电引力增 破碎后，可用pH7.8的磷酸缓冲 大。同时，有机溶剂的亲水性比 溶液提取出来。由于SOD不溶于 溶质分子的亲水性强，它会抢夺 丙酮，可用丙酮将其沉淀析出。 本来与亲水溶质结合的自由水， 破坏其表面的水化膜，导致溶质 分子之间的相互作用增大而发生 聚集，从而沉淀析出。
真核细胞细胞质 原核及真核细胞线 粒体 原核细胞


颜色
蓝绿色 紫红色 黄褐色
举例
猪血、猪肝 人和狒狒肝细胞的 胞液 绿菌属、脱硫弧菌 属
主要来源：大蒜蒜瓣（含有丰富的SOD酶）
di
er
zhang
jie
第 二 章 节
1、SOD酶的提取原理 2、实训准备（材料与仪器) 3、酶的生产工艺流程图
SOD酶的提取原理
除 杂 蛋 白
弃沉淀取上清 以6000r/min离心 15min 搅拌15min 于上清液中加入1/4 倍体积氯仿-乙醇 混合液
用凝胶Sephacryl S-200进行纯化
Baidu Nhomakorabea
纯 化
弃沉淀取 上清
进行超滤浓缩得到 SOD酶
di
san
zhang
jie
第 三 章 节
1、SOD酶检验的原理
2、实训准备（材料、仪器） 3、SOD酶检验步骤