核酸的分离纯化和鉴定
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0.5×TBE缓冲液, 加热熔解备用。 5．6×凝胶上样缓冲液：0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯
青FF，30%甘油溶于水中，4℃保存。 6．DNA分子量标准
【操作步骤】
1．琼脂糖凝胶板的制备：将1%－2%琼脂糖凝胶加热 溶化均匀，冷却到65℃加EB至终浓度0.5μg/ml，倒 入凝胶槽，厚度约3－5mm，放置样品梳，待冷却 成形后取出梳子及隔板，放入水平电泳槽中，缓冲 液淹没过胶1－2mm为止。
【试剂】
1．6 mol/L NaI 2．氯仿/异戊醇(24:1 V/V)混合液，应在棕色密封瓶中
保存。 3．异丙醇（isopropanol）(A.R) 4．37% 异丙醇或70%乙醇 5．双蒸水(ddH2O) (高压灭菌) 6．TE缓冲液 (pH 8.0) (10 mmol/L Tris-Cl、1
DNA的琼脂糖凝胶电 泳
原理
DNA分子带负电荷，在电场中受到电荷效应、分 子筛效应向正极移动过程中, 因DNA分子的大小 及构象差别而呈现迁移位置上的差异，对于线形 DNA分子，其电场中的迁移率与其分子量的对数 值成反比。电泳时加溴化乙锭（EB），其与DNA 结合形成一种荧光络合物，在254－365nm紫外 线照射下可产生桔红色的荧光，可用于检测DNA。
2．上样缓冲液中适量的甘油，蔗糖或聚蔗糖400可增加样品密度， 使样品均匀沉到样孔底，而溴酚蓝、二甲苯青可使样品带色，便 于上样及估计电泳时间和判断电泳位置。
3．EB是一种强烈诱变剂并有中度毒性，应戴手套操作，对于含有EB 的溶液用后应妥善净化处理。
4．电泳过程中，EB向阴极移动，延长电泳时间，EB会从凝胶中迁移 出来，从而使小片段DNA难于检测，可将凝胶浸在0.5 μg/ml EB 溶液中重新染色后检测。
真核DNA提取的主要步 骤
真核生物的一切有核细胞（包括培养细胞）都 可以用来制备基因组DNA。 温和裂解细胞，溶解DNA，使DNA与组蛋白
分离； 采用化学或酶学方法去除蛋白质、RNA及其他
大分子。
外周血白细胞DNA的提取
原理
（NaI法）
利用双蒸水低渗溶胀红细胞及白细胞膜，释放出血 红蛋白及细胞核，NaI破核膜并有效解离DNA-蛋白质复 合物，使核酸处于易提取状态， 再以氯仿/异戊醇抽提 （蛋白质变性沉淀并溶解脂类，异戊醇可减少抽提过程 中的泡沫产生），离心后DNA存在于上层水相中，以 37%异丙醇沉淀及洗涤DNA，即获得白细胞DNA。用 此法提取的DNA可用于Southern 杂交、PCR的模板等。
DNA测序 基因表达分析（RNA详细结构和数量的分析）
DNA的鉴定
一、紫外法测DNA的纯度及浓度
原理：
组成核酸的嘌呤嘧啶碱基均有紫外吸收特性，最大 吸收峰在260nm，这是紫外测定核酸的基础。蛋 白质在280nm处有最大的吸收峰，盐和小分子则 集中在230nm处。OD值为1时相当于大约 50μg/ml双链DNA 。通过测定A260和A280的比 值可估算核酸的纯度。紫外法仅用于测定浓度大于 0.25μg/ml的核酸溶液。
2．加样：样品中加1/5体积的6×凝胶上样缓冲液，混 匀，取15μl加入凝胶点样孔中。同时要设立合适的 DNA分子量标准物。
3．电泳：电压2－10V/cm 胶, 待溴酚蓝移至凝胶的2/3 距离时，关闭电源。
4．取出凝胶块，置紫外透射反射分析仪上观察，即可 见桔红色的DNA区带。
【注意事项】
1．加样时勿破坏样品孔，否则DNA带型不整齐。
1. 标本必须新鲜，提取前细胞应保持完整。所用Ep管、滴头 等用品及ddH2O、试剂等应高压灭菌，操作尽量在4℃以下 进行。
2. 混匀试剂、吸取上清液等操作时应避免动作剧烈。 3. 弃去异丙醇时动作应轻，切忌甩干，以免DNA丟失。 4. 0.54-1倍的异丙醇可选择性沉淀DNA和大分子rRNA和
mRNA，但对5SRNA、tRNA及多糖不产生沉淀。一般不需 在低温条件下长时间放置。其缺点是易使盐类与DNA共沉 淀；在DNA沉淀中的异丙醇难以挥发除去，所以常规需要 70%乙醇漂洗DNA沉淀物。 5. 室温下放置16h或65℃放置1h, 可加快基因组DNA沉淀的溶 解。
5．加样孔的加样量依DNA样品中片段的数量及大小而定，通常对 0.5cm宽的加样孔，DNA上样量在0.1－0.5μg即可有良好的观察 效果。
6．小的凝胶——微型和中型凝胶的电泳一般比大凝胶要快，常用于 快速分析。小胶通常要在高电压下电泳(＞10 V/cm)。应注意电泳 槽盛装缓冲液的体积要相对较大。
பைடு நூலகம்
【试剂与材料】
1．5×TBE缓冲液(pH 8.3)：54 g Tris碱, 27.5 g硼酸, 20 ml 0.5 mol/L EDTA(pH8.0), 加水至1 L。
2．0.5×TBE缓冲液 (pH 8.3) 3．溴化乙锭(EB)： 5 mg/ml 4．1－2% 琼脂糖凝胶: 琼脂糖1－2 g加至100 ml
核酸凝胶电泳
核酸是带均匀负电荷的分子，在电场中向正极移 动，不同大小和构象的核酸分子的电荷密度大致 相同，在自由泳动时，各核酸分子的迁移率区别 很小，难以分开。以适当浓度的凝胶介质作为电 泳支持介质，具有分子筛效应，使得分子大小和 构象不同的核酸分子泳动率出现较大差异，达到 分离的目的，此为分离、鉴定和纯化核酸片段的 标准方法。
思考题
1、分离核酸的基本原则包括哪两方面？ 2、试比较用EB进行DNA凝胶电泳前（加在上样
缓 冲液中）、电泳中（加在凝胶中）、电泳后 （凝胶浸泡于EB溶液中）的染色过程，各有 何有优缺点？
核酸的分离纯化和鉴定
核酸包括DNA、RNA，在细胞中都与蛋白质结合 而存在。
分离纯化核酸总的原则 :
1、保证一级结构的完整性，完整的一级结构是研究核酸 结构和功能的基础； 减少化学、物理、生物因素对核酸的降解：
避免过酸、过碱对磷酸二酯键的破坏； 避免机械剪切力以及高温煮沸； 抑制DNase或RNase的活性； 2、排除蛋白质、脂类、糖类等分子的污染。
mmol/L EDTA) 高压灭菌。
操作步骤
1. 取新鲜抗凝血100μl置Ep管中, 离心10000rpm×1 min。 2. 弃上清，加ddH2O 200μl, 摇匀20s。 3. 加6mol/L NaI 200μl, 缓慢倒置摇匀20s。 4. 于管内加氯仿/异戊醇(24:1)400μl, 缓慢颠倒混匀两相，
核酸的鉴定与分析
紫外分光光度法可用于确定核酸的浓度及纯度。
核酸的分级分离。层析技术及凝胶电泳法，凝胶电泳 分离法分制备型和分析型，根据分离核酸片段的大小 可选择不同参数或条件的琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝 胶电泳。
核酸杂交技术用于鉴别某个特定的片段。
多聚酶链反应（polymerase chain reaction, PCR） 对目的基因进行DNA序列分析及鉴定 。
操作
取15μl DNA样品于3ml双蒸水中，分别于260、280、230nm处比 色并记录。 定量分析： DNA＝A260×核酸稀释倍数(3000/15)×50/1000
=10×A260(ug/ul) 纯度分析：
DNA A260/A280=1.8 A260/A280>1.8，有RNA杂质，用RNase消化； A260/A280<1.7,有杂蛋白，重复抽提纯化步骤; A260/A230<2.0，可能有盐未除尽。 注：此法不能区分DNA和RNA，不能用于核酸粗制品的测定。
Water phase(DNA)
7. 小心弃去上清，再加37%异丙醇（或70%乙醇）1 ml(勿摇动)，离心14000rpm×12min.
8. 小心弃异丙醇（或乙醇），于室温敞口放置直至可 见的痕量液体挥发殆尽。
9. 加50μl TE缓冲液溶解DNA, 以琼脂糖凝胶电泳鉴定 或-20℃保存。
【注意事项】
离心10 000rpm×10min。 5. 吸取上层水相350μl置一新Ep管中，加纯异丙醇200μl,
混匀。 6. 室温放置15min, 离心14 000rpm×12min。
STEP 5
Water phase (DNA) proteins precipitate
chloroform /isoamyl alcohol (lipids)
青FF，30%甘油溶于水中，4℃保存。 6．DNA分子量标准
【操作步骤】
1．琼脂糖凝胶板的制备：将1%－2%琼脂糖凝胶加热 溶化均匀，冷却到65℃加EB至终浓度0.5μg/ml，倒 入凝胶槽，厚度约3－5mm，放置样品梳，待冷却 成形后取出梳子及隔板，放入水平电泳槽中，缓冲 液淹没过胶1－2mm为止。
【试剂】
1．6 mol/L NaI 2．氯仿/异戊醇(24:1 V/V)混合液，应在棕色密封瓶中
保存。 3．异丙醇（isopropanol）(A.R) 4．37% 异丙醇或70%乙醇 5．双蒸水(ddH2O) (高压灭菌) 6．TE缓冲液 (pH 8.0) (10 mmol/L Tris-Cl、1
DNA的琼脂糖凝胶电 泳
原理
DNA分子带负电荷，在电场中受到电荷效应、分 子筛效应向正极移动过程中, 因DNA分子的大小 及构象差别而呈现迁移位置上的差异，对于线形 DNA分子，其电场中的迁移率与其分子量的对数 值成反比。电泳时加溴化乙锭（EB），其与DNA 结合形成一种荧光络合物，在254－365nm紫外 线照射下可产生桔红色的荧光，可用于检测DNA。
2．上样缓冲液中适量的甘油，蔗糖或聚蔗糖400可增加样品密度， 使样品均匀沉到样孔底，而溴酚蓝、二甲苯青可使样品带色，便 于上样及估计电泳时间和判断电泳位置。
3．EB是一种强烈诱变剂并有中度毒性，应戴手套操作，对于含有EB 的溶液用后应妥善净化处理。
4．电泳过程中，EB向阴极移动，延长电泳时间，EB会从凝胶中迁移 出来，从而使小片段DNA难于检测，可将凝胶浸在0.5 μg/ml EB 溶液中重新染色后检测。
真核DNA提取的主要步 骤
真核生物的一切有核细胞（包括培养细胞）都 可以用来制备基因组DNA。 温和裂解细胞，溶解DNA，使DNA与组蛋白
分离； 采用化学或酶学方法去除蛋白质、RNA及其他
大分子。
外周血白细胞DNA的提取
原理
（NaI法）
利用双蒸水低渗溶胀红细胞及白细胞膜，释放出血 红蛋白及细胞核，NaI破核膜并有效解离DNA-蛋白质复 合物，使核酸处于易提取状态， 再以氯仿/异戊醇抽提 （蛋白质变性沉淀并溶解脂类，异戊醇可减少抽提过程 中的泡沫产生），离心后DNA存在于上层水相中，以 37%异丙醇沉淀及洗涤DNA，即获得白细胞DNA。用 此法提取的DNA可用于Southern 杂交、PCR的模板等。
DNA测序 基因表达分析（RNA详细结构和数量的分析）
DNA的鉴定
一、紫外法测DNA的纯度及浓度
原理：
组成核酸的嘌呤嘧啶碱基均有紫外吸收特性，最大 吸收峰在260nm，这是紫外测定核酸的基础。蛋 白质在280nm处有最大的吸收峰，盐和小分子则 集中在230nm处。OD值为1时相当于大约 50μg/ml双链DNA 。通过测定A260和A280的比 值可估算核酸的纯度。紫外法仅用于测定浓度大于 0.25μg/ml的核酸溶液。
2．加样：样品中加1/5体积的6×凝胶上样缓冲液，混 匀，取15μl加入凝胶点样孔中。同时要设立合适的 DNA分子量标准物。
3．电泳：电压2－10V/cm 胶, 待溴酚蓝移至凝胶的2/3 距离时，关闭电源。
4．取出凝胶块，置紫外透射反射分析仪上观察，即可 见桔红色的DNA区带。
【注意事项】
1．加样时勿破坏样品孔，否则DNA带型不整齐。
1. 标本必须新鲜，提取前细胞应保持完整。所用Ep管、滴头 等用品及ddH2O、试剂等应高压灭菌，操作尽量在4℃以下 进行。
2. 混匀试剂、吸取上清液等操作时应避免动作剧烈。 3. 弃去异丙醇时动作应轻，切忌甩干，以免DNA丟失。 4. 0.54-1倍的异丙醇可选择性沉淀DNA和大分子rRNA和
mRNA，但对5SRNA、tRNA及多糖不产生沉淀。一般不需 在低温条件下长时间放置。其缺点是易使盐类与DNA共沉 淀；在DNA沉淀中的异丙醇难以挥发除去，所以常规需要 70%乙醇漂洗DNA沉淀物。 5. 室温下放置16h或65℃放置1h, 可加快基因组DNA沉淀的溶 解。
5．加样孔的加样量依DNA样品中片段的数量及大小而定，通常对 0.5cm宽的加样孔，DNA上样量在0.1－0.5μg即可有良好的观察 效果。
6．小的凝胶——微型和中型凝胶的电泳一般比大凝胶要快，常用于 快速分析。小胶通常要在高电压下电泳(＞10 V/cm)。应注意电泳 槽盛装缓冲液的体积要相对较大。
பைடு நூலகம்
【试剂与材料】
1．5×TBE缓冲液(pH 8.3)：54 g Tris碱, 27.5 g硼酸, 20 ml 0.5 mol/L EDTA(pH8.0), 加水至1 L。
2．0.5×TBE缓冲液 (pH 8.3) 3．溴化乙锭(EB)： 5 mg/ml 4．1－2% 琼脂糖凝胶: 琼脂糖1－2 g加至100 ml
核酸凝胶电泳
核酸是带均匀负电荷的分子，在电场中向正极移 动，不同大小和构象的核酸分子的电荷密度大致 相同，在自由泳动时，各核酸分子的迁移率区别 很小，难以分开。以适当浓度的凝胶介质作为电 泳支持介质，具有分子筛效应，使得分子大小和 构象不同的核酸分子泳动率出现较大差异，达到 分离的目的，此为分离、鉴定和纯化核酸片段的 标准方法。
思考题
1、分离核酸的基本原则包括哪两方面？ 2、试比较用EB进行DNA凝胶电泳前（加在上样
缓 冲液中）、电泳中（加在凝胶中）、电泳后 （凝胶浸泡于EB溶液中）的染色过程，各有 何有优缺点？
核酸的分离纯化和鉴定
核酸包括DNA、RNA，在细胞中都与蛋白质结合 而存在。
分离纯化核酸总的原则 :
1、保证一级结构的完整性，完整的一级结构是研究核酸 结构和功能的基础； 减少化学、物理、生物因素对核酸的降解：
避免过酸、过碱对磷酸二酯键的破坏； 避免机械剪切力以及高温煮沸； 抑制DNase或RNase的活性； 2、排除蛋白质、脂类、糖类等分子的污染。
mmol/L EDTA) 高压灭菌。
操作步骤
1. 取新鲜抗凝血100μl置Ep管中, 离心10000rpm×1 min。 2. 弃上清，加ddH2O 200μl, 摇匀20s。 3. 加6mol/L NaI 200μl, 缓慢倒置摇匀20s。 4. 于管内加氯仿/异戊醇(24:1)400μl, 缓慢颠倒混匀两相，
核酸的鉴定与分析
紫外分光光度法可用于确定核酸的浓度及纯度。
核酸的分级分离。层析技术及凝胶电泳法，凝胶电泳 分离法分制备型和分析型，根据分离核酸片段的大小 可选择不同参数或条件的琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝 胶电泳。
核酸杂交技术用于鉴别某个特定的片段。
多聚酶链反应（polymerase chain reaction, PCR） 对目的基因进行DNA序列分析及鉴定 。
操作
取15μl DNA样品于3ml双蒸水中，分别于260、280、230nm处比 色并记录。 定量分析： DNA＝A260×核酸稀释倍数(3000/15)×50/1000
=10×A260(ug/ul) 纯度分析：
DNA A260/A280=1.8 A260/A280>1.8，有RNA杂质，用RNase消化； A260/A280<1.7,有杂蛋白，重复抽提纯化步骤; A260/A230<2.0，可能有盐未除尽。 注：此法不能区分DNA和RNA，不能用于核酸粗制品的测定。
Water phase(DNA)
7. 小心弃去上清，再加37%异丙醇（或70%乙醇）1 ml(勿摇动)，离心14000rpm×12min.
8. 小心弃异丙醇（或乙醇），于室温敞口放置直至可 见的痕量液体挥发殆尽。
9. 加50μl TE缓冲液溶解DNA, 以琼脂糖凝胶电泳鉴定 或-20℃保存。
【注意事项】
离心10 000rpm×10min。 5. 吸取上层水相350μl置一新Ep管中，加纯异丙醇200μl,
混匀。 6. 室温放置15min, 离心14 000rpm×12min。
STEP 5
Water phase (DNA) proteins precipitate
chloroform /isoamyl alcohol (lipids)