改进溶析结晶提纯葛根素

晶体得率 /% 10. 0 ± 0. 3 37. 6 ± 0. 8 45. 7 ± 0. 5
2. 3 不同纯化阶段的液相色谱图对照 图 6 中，A 为结晶前葛根异黄酮的液相谱图，其中葛根
素的含量为 45% ，3′-甲氧基葛根素含量为 7. 32% ，还有其它
A
杂质；B 为经改进溶析法结晶后用一定浓度的醋酸洗涤干燥 后葛根素的液相谱图，经检测葛根素含量提高到 87. 8% ，并 且 3′-甲氧基葛根素、大豆苷元和其他杂质也基本被除去。 3结论
S212 型 恒 速 搅 拌 器 （ 上 海 申 顺 生 物 科 技 有 限 公 司） 、 DDD-320 型多功能电子蠕动泵（ 上海之信仪器有限公司） 、
Agilent 1200 型 高 效 液 相 色 谱 仪 （ 美 国 安 捷 仑 公 司 ） 、 SK3300LH 型超声波清洗机 （ 上海科导超 声 波 仪 器 有 限 公 司） 。 1. 3 实验步骤 1. 3. 1 传统醋酸冷却及超声波结晶 称取葛根异黄酮 5. 00 g，加入 10 倍冰醋酸，在 90 ℃ 下溶解（ 冷却法） 或在超 声波中振荡 40 min（ 超声波法） ，然后转移至室温下冷却 1 h， 过滤，真空干燥，得到初结晶葛根素，两种方法各实验 3 次。 1. 3. 2 改进溶析结晶 称取葛根异黄酮 15. 00 g，用 15 mL 甲醇使其刚好完全溶解，得到的溶解液。各取一定量的冰醋 酸分别做为溶析液和底物，在一定温度及搅拌速度下，将溶 解液与溶析液缓慢滴加到底物中，加入完毕后继续搅拌 2 h， 过滤，洗涤，真空干燥，得到结晶葛根素。 1. 4 分析方法 1. 4. 1 色 谱 条 件 色 谱 柱 为 ZORBAX. SB-C18 （5 μm，4. 6 mm × 150 mm） ，流动相为甲醇-水（25 ∶ 75） ，流速为 1. 0 mL / min，室温，检测波长为 250 nm。 1. 4. 2 标准曲线的绘制 精密称取葛根素对照品 5 mg，定 容于 10 mL 的量瓶中。在上述色谱条件下进样，进样量分别 为 2、4、6、8、10 μL，记录色谱峰面积。在 2 ～ 10 μL 时，色谱 峰面 积 与 进 样 量 呈 线 性 关 系。线 性 回 归 方 程 为： Y = 2 054. 5X － 121. 02，r = 0. 999 8，线性范围：1 ～ 5 μg。 1. 4. 3 葛根素样品的制备 精密称取提纯后的葛根素约 16. 4 mg，定容于 25 mL 的量瓶中。在上述色谱条件下进行 分析，进样量为 6 μL，记录色谱峰面积。 2 结果与讨论 2. 1 结晶条件对葛根素纯度和得率的影响 2. 1. 1 结晶温度 图 1 为搅拌速率 60 r / min，底物用量为
不是太长。从表中可知，改进溶析法所得到的葛根素在晶体
纯度和得率上都远远高于传统法和超声波法。
表1
不同结晶方法结果比较（n = 3）
结晶方式 传统法 超声波法 改进溶析法
Leabharlann Baidu
结晶时间 / min 210 100 300
晶体纯度 /% 81. 8 ± 0. 4 77. 2 ± 1. 0 87. 8 ± 0. 6
摘要：目的：提出一种改进的溶析结晶方法，从葛根异黄酮中提纯葛根素。方法：该法先用甲醇溶解葛根异黄酮得到溶解
液，以葛根素溶解度很小的冰醋酸作为溶析液；在一定的温度和搅拌速率下，将溶解液与溶析液同时滴加到开始具有一
定底物的结晶器中，进行结晶操作。结果：采用葛根素含量为 45% 的葛根异黄酮，在温度为 50 ℃ 、搅拌速度为 60 r / min、
参考文献：
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中成药 Chinese Traditional Patent Medicine
October 2010 Vol. 32 No. 10
改进溶析结晶提纯葛根素
陈晓光， 韦藤幼， 贾守洁， 童张法* （ 广西大学化学化工学院，广西 南宁 530004）
关键词：葛根素； 溶析结晶； 纯化； 葛根异黄酮
葛根异黄酮，采用产自陕西省的野葛根 Pueraria lobata （ Willd. ） Ohwi，按文献［10］方法提取制备，经高效液相色谱 检测葛根素含量为 45% 。葛根素标准品（98% ，购于中国药 品生物制品检定所，批号 1107522200511） ；甲醇（ 分析纯，广 东汕头市西陇化工厂） ；冰醋酸（ 分析纯，广东汕头市西陇化 工厂） ；甲醇，（ 一级色谱纯，广东汕头市西陇化工厂） 。 1. 2 实验设备
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图 4 结晶时间对葛根素得率及纯度的影响 不上加料速度，导致过饱和度过大，在体系中出现了二次成 核现象，虽然收率高，但葛根素晶体颗粒小、纯度低；滴加时 间长、速度慢时，由于过饱和度过太小，结晶速度慢，效果也 差。只有控制合适的加料速度，使滴加速度与晶体生长速度 同步，在一定的得率下得到的晶体纯度才最高。 2. 1. 5 溶解液与溶析液比例 图 5 为温度 50 ℃ ，搅拌速率 60 r / min，底物用量为溶解液 0. 8 倍，滴加时间为 3 h 时，溶 析液与溶解液用量比例对葛根素得率与纯度的影响。从图 中可以看出，葛根素的纯度与得率随着溶析液与溶解液用量 比的增大而提高，在 1 ∶ 1 时达到最大值后，随着溶析液与溶 解液的比例增加而降低。这是因为随着溶析液与溶解液用 量比的增大，结晶母液的过饱和度增大，葛根素结晶的成核 速率与生长速率也增大，因此葛根素的纯度与得率也随之提 高。但是当溶析液与溶解液用量比超过 1 ∶ 1 以后，结晶母 液的溶解度趋近于不变，而溶析液相对过多，不仅影响了晶 体的生长，而且溶解了部分葛根素，导致了得率和纯度下降。
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溶解液 0. 8 倍，溶解液与溶析液用量比为 1 ∶ 1，滴加时间为 3 h 时，不同结晶温度对葛根素得率与纯度的影响。从图中 可以看出，葛根素的纯度与得率随着温度的变化均存在最佳 值。这是因为温度升高，溶液黏度减小，有利于晶体的生长， 但溶解度下降，结晶困难，50 ℃ 为最佳温度。
收稿日期：2009-08-16 基金项目：广西科学研究与技术开发计划课题（ 桂科能 05112001-3A6） 作者简介：陈晓光（1981 － ） ，男，在读博士生，研究方向：基本有机化工。E-mail：chen_007051@ sina. com * 通讯作者：童张法（1963 － ） ，教授，博士生导师。E-mail：bioche@ gxu. edu. cn
时间、晶体纯 度 与 得 率 方 面 的 比 较。 传 统 法 与 超 声 波 法 相 比，在普通加热条件下的分子运动强度相对于超声波条件下
的分子运动强度弱，有利于晶体的成长，因而加热条件下所
得的葛根素晶体纯度最高。超声波结晶属于刺激结晶，浸膏 的醋酸溶液处于超声波条件下，促使葛根素分子骤然加速聚 集，导致新相的晶核能够迅速生成，因此超声波结晶要比加
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图 3 底物用量对葛根素得率及纯度的影响
图 1 结晶温度对葛根素得率及纯度的影响 2. 1. 2 搅拌速率 图 2 为温度 50 ℃ ，底物用量为溶解液 0. 8 倍，溶解液与溶析液用量比为 1 ∶ 1，滴加时间为 3 h 时， 搅拌速率与葛根素得率和纯度的关系。从图中可以看出，开 始时葛根素的 纯 度 与 得 率 随 着 搅 拌 速 率 的 提 高 而 上 升，在 60 r / min 时达到最大值后降低。这是因为搅拌可以促进传 质，有利于维持均匀的过饱和度，可以提高葛根素的纯度和 得率。但是搅拌 速 率 过 大，影 响 了 晶 核 的 形 成 与 晶 体 的 生 长，故纯度与得率均下降。
热结晶速度快，但是超声波结晶是骤变的过程，影响因素颇
多，在加速葛根素结晶的形成过程中，也相应加速了部分杂 质在醋酸中的析出，导致了纯度的下降。而改进溶析结晶法 是利用了底物维持了结晶过程的过饱和度，使得葛根素在结
晶过程中能够始终保持着合适的过饱和度，这样既保证了较
高的晶体得率，又保证了较高的晶体纯度，而且结晶时间也
图 2 搅拌速率对葛根素得率及纯度的影响 2. 1. 3 底物用量 图 3 为温度 50 ℃ ，搅拌速率 60 r / min，溶 解液与溶析液用量比为 1 ∶ 1，滴加时间为 3 h 时，不同底物 用量对葛根素得率与纯度的影响。从图中可以看出，葛根素 的纯度随着底物用量的增加而升高，而得率则随着底物用量 的增加而降低。这是因为随着底物用量的增加，结晶母液的 黏度降低，有利于晶体的生长，故纯度增大，但随着底物用量 增大，结晶母液的溶解度变化不大，由于底物用量的加大，致 使部分葛根素溶于底物，导致葛根素的得率降低。为了保证 葛根素较高的 收 率 和 纯 度，所 以 最 佳 的 底 物 用 量 为 溶 解 液 0. 8 倍。 2. 1. 4 滴加时间 图 4 为温度 50 ℃ ，搅拌速率 60 r / min，底 物用量为溶解液 0. 8 倍，溶解液与溶析液用量比为 1 ∶ 1 时， 不同滴加时间的影响。从图中可以看出，葛根素的纯度随滴 加时间的延长而降低，得率则随滴加时间的延长存在最佳值 为 4h。这是因为滴加时间短、速度快时，体系的结晶速度跟
溶析液与溶解液的用量比为 1 ∶ 1、底物用量为溶解液 0. 8 倍及滴加时间为 4 h 时结晶，得到的葛根素粗品的纯度达到
87. 8% ，得率为 89. 3% 。结论：采用改进的溶析法结晶提纯葛根素，其纯度和得率远远大于传统冷却结晶和超声波结晶。
中图分类号：R284. 2
文献标识码：B
文章编号：1001-1528（2010）10-1791-03
溶析法结晶法［8］操作温度低，但是它的过饱和度不易控 制，得到的晶体颗 粒 小，纯 度 低。 本 实 验 参 照 文 献［9 ］的 方 法，提出了改进溶析结晶法，并用其对葛根异黄酮进行提纯， 得到葛根素的纯度达到 87. 8% ，得率为 89. 3% ，在纯度和得 率上远远高于传统结晶法和超声波结晶法。 1 实验 1. 1 实验材料
图 5 溶析液与溶解液之比对葛根素得率及纯度的影响 2. 2 不同结晶方法的比较
表 1 给出了传统法、超声波法与改进溶析法结晶在结晶
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在葛根素不同结晶方法的比较中，虽然改进溶析结晶法 耗时较长，但与传统法、超声波法结晶相比，葛根素晶体的纯 度与得率提高了很多。改进溶析结晶法能够有效除去 3′-甲 氧基葛根素、大豆苷元等葛根素衍生物，提高了葛根素的纯 度。
改进溶析结晶法纯化葛根素的最佳工艺为：水浴温度为 50 ℃ ，搅拌速度为 60 r / min，溶析 液 与 溶 解 液 的 用 量 比 为 1 ∶ 1，底物用量为溶解液 0. 8 倍，滴加时间为 4 h 条件下结 晶，葛根素的纯度可达到 87. 76% ，得率为 89. 3% 。
葛根为豆科植物野葛 Pueraria lobata （ Willd. ） Ohwi 的 干燥根，习称野葛。葛根中的葛根素具有调节血压、增加冠 脉血流量、改善脑循环、抑制血小板聚集、抗氧化自由基等作 用，临床应用于冠心病、心绞痛均取得了明显的疗效［1］。但 用于注射液中葛根素纯度要求高，否则易引起发热、过敏性 皮疹、过敏性休克等症状［2］。目前用于葛根素纯化的方法有 结晶法、溶 剂 萃 取 法［3］和 柱 层 析 法［4-5］等。传 统 的 冷 却 结 晶［6］及超声波结 晶［7］对 分 离 葛 根 素 衍 生 物 效 果 较 差，往 往 需要在结晶前用酸水解法分解葛根素衍生物，并且产率都在 1. 5% 以下。溶剂萃取法与柱层析法虽然也可得到高含量的 葛根素，但需要经过反复萃取或层析，工艺较繁琐，规模生产 成本较高。