AOAC低聚半乳糖检测方法

Gb C Gb×D1×(M 9 M 7 )
F×M 8×100
其中，CGb=mg 半乳糖/kg 未水解溶液 A1；F 为因子，计算公式如下： F M 2×100 M 3 M 1

G 1 C Gt×D2×(M 6 M 4 )
F×M 5×100
其中，CGt=mg 半乳糖/kg 酶解溶液 A2。
溶液 WS1 WS2 WS3 WS4
mLS1 5.00 10.00 15.00 20.00
mLS2 5.00 10.00 15.00 20.00
半乳糖+乳糖 4ug/mL + 7.125 ug/mL 8ug/mL + 14.25 ug/mL 12ug/mL+21.375ug/mL 16ug/mL + 28.5 ug/mL
D2b 250 300 200 125 200 200
D3c 100 100 100 30 60 200
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a D1 = 分析液 A1 中半乳糖的稀释因子 b D2 = 分析液 A2 中半乳糖的稀释因子 c D3 = 分析液 A1 中乳糖的稀释因子 测定—对测试溶液和标准工作溶液使用相同类型的积分， 包括选择相同的峰宽、 阈值和 其它的积分参数。控制基线设定，通过峰面积定量。 首先测定每种糖的4个标准糖溶液，建立线性关系。重复测定这4个标准溶液。两套标准 溶液之间，跑9个测试样[如 WS1，WS2，WS3，WS4，未酶解溶液 1A1（稀释因子 D1）， 未酶解溶液1A1（稀释因子D3），酶解溶液1A2，未酶解溶液2A1（稀释因子D1），未酶解溶 液2A1（稀释因子D3），酶解溶液2A2，未酶解溶液3A1（稀释因子D1），未酶解溶液 3A1 （稀释因子 D3），酶解溶液 3A2，WS1，WS2，WS3，WS4，未酶解溶液4A1（D1），未酶 解溶液4A1（D3），酶解溶液 4A2 等]，按照程序将所有的样品测试完。使用标准溶液的响 应因子，计算测试样品溶液中的糖浓度。 可能的干扰： 半乳糖是检测产品中低聚半乳糖含量的最重要参数。 如果谷粉和奶粉类产 品， 乳糖含量高， 酶水解后半乳糖的检测误差会影响从低聚半乳糖中释放出的半乳糖的检测； 也可能存在α-半乳聚糖（如角豆胶粉）经β-半乳糖酶非选择性水解，导致不稳定的结果。因 此，使用新鲜制备的酶。 8 计算 计算缓冲液提取液A1中的初始的半乳糖含量Gb和乳糖含量Lb，水解溶液A2（g/100g 测 试样品）中的半乳糖含量，公式如下：
Lb C Lb×D3×(M 9 M 7 ) F×M 8×00
其中，CLb=mg 乳糖/kg 未酶解溶液 A1。 计算从低聚半乳糖（Gg）中释放的半乳糖（g/100g 测试样品） Gg= Gt-Gb-Gl
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其中，Gl=从乳糖中释放出的半乳糖=Lb/1.9 计算低聚半乳糖含量（g/100g 测试样品）： GOS=k×Gg 其中，k=（180+162n）/（180n）。n为低聚半乳糖分子中半乳糖部分的平均数。例如， n=2，k=1.4
表1-1 HPAEC-PAD 分析的洗脱梯度
流动相（%） 时间（分） 0.00 20.10 35.00 36.00 36.10 46.00 46.10 61.00 A 95 95 0 0 0 0 95 95 B 5 5 100 100 0 0 5 5 C 0 0 0 0 100 100 0 0
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表1-2 HPAEC-PAD 分析的监测器程序
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附录：AOAC 法定方法 2001.02 食品中 GOS 的检测方法， 离子交换色谱法
1 原理 用热的磷酸盐缓冲液从待测样品中提取低聚半乳糖和乳糖， 用β-半乳糖苷酶将提取液 中的 GOS 和乳糖水解。将提取原液和分解液分别用脉冲电子监测高效阴离子交换色谱 （HPAEC-PAD）。检测出原液中的游离的半乳糖和乳糖，和分解液中GOS释放出的半乳 糖总量，从乳糖和半乳糖的浓度可以算出GOS的量。 2 材料和仪器 高效阴离子交换色谱（HPAEC）--- 液相色谱梯度泵，脱气装置，微量进样阀，脉冲 电子监测器（1.0mm 直径金工作电极和pH-Ag/AgCl 参考电极；电池体作为反电极）以脉冲 电流测定模式工作（PAD），自动取样器（Dionex 公司，PO Box 3603，Sumnyvale，CA 94088-3603 ， 美 国 ， +1-408-737-0700 ， 传 真 ： +1-408-730-9403） 和数据积分仪 （Shimadzu, 1 Nishinokyo Kuwabaracho, Nakagyou-ku, Kyoto 604-8511，日 本 ，+81-75-825-1111，传真： +81-75-823-1361） HPAEC 条件 --- 柱温：常温 20-30℃±0.5℃，最好在 20℃±0.5℃；流速： 1.0mL/分钟；进样量：20µL；监测器灵敏度：模拟范围 1-3µC。见表1-1 和 1-2，洗脱程序 和监测器程序。优化色谱时可能会改变参数。
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4 样品制备 分析前均质液体样品。打碎硬粒，过1mm2筛（18号筛）。 5 提取 称量精确到1mg。 称量带螺旋盖的50mL塑料瓶（M1）。称量一定数量样品，含GOS和乳糖共约0.1-0.3g， 但样品量不要超过10g，放入这个50mL的塑料瓶（M2，测试样部分）。加约40mL热的磷酸 缓冲液（约80度），盖上盖子混合。将塑料瓶在 80±2℃水浴，并搅拌30分钟后，放入冰浴 冷却至室温。测量 pH 值并用 1M NaOH 或 1M HCl 调节至 5.7-6.3。用磷酸缓冲液稀释至约 50mL。称瓶、盖及溶液的重量，计算测试提取液的重量（M3）。 6 酶解 6.1 溶液处理—称重带螺旋盖的塑料瓶（M4），取5中的提取液20g，放入瓶中，样品的 净重为 M5。移取1mL的β-半乳糖酶溶液，放入瓶中，盖紧瓶盖，混合。 6.2 初始测试溶液—称重带螺旋盖的塑料瓶 （M7） ， 移取1mL 的β-半乳糖酶溶液和 1mL 磷酸盐缓冲液100℃水浴10分钟，灭酶，冷却。称取5中的提取液20g，放入瓶中，样品净重 为M8，盖紧盖子，混合。将以上活性酶溶液和灭酶溶液在 60±2℃培养30分钟，连续轻微搅 拌，当溶液温度到达60℃时开始计加热时间。在搅拌期间，避免泡沫或气泡产生。用冰浴冷 却。 添加5mL 20%乙腈到6.1溶液中，混合，称重盖紧盖子的瓶子（M6），添加4mL 20%乙 腈到6.2溶液中，混合，称重盖紧盖子的瓶子（M9）。离心溶液（10000*g，10分钟），上清 液经0.2μm滤膜过滤，滤液浓缩处理。酶失活提取物溶液称为A1，水解提取物溶液称为A2。 7 乳糖和半乳糖测定 HPAEC-PAD 分析的测试液制备： 用3%乙腈稀释6中的离心滤液， 使半乳糖和乳糖含量 在工作标准溶液浓度范围内。根据检测原料的不同，可能需要3个不同的稀释因子。见表3。
时间（秒） 0.00 0.20 0.40 0.41 0.60 0.61 1.00
电位（v） 0.05 0.05 0.05 0.75 0.75 -0.15 -0.15 Nhomakorabea积分
开始 结束
柱：CarboPac PA-1 薄层阴离子交换树脂，250×4mm 内径和50×4mm 内径引柱，树脂 都是由磺化乙烯基苯-二乙烯基苯颗粒组成，用 350µm 的四价胺基功能化胶液微粒聚合。 pH 计； 塑料瓶：50mL，带螺旋盖，耐 100℃高温； 水浴锅：带搅拌器，控制温度在 60±2℃和 80±2℃； 氦气：设备级，纯度 99.996%。 注射器：10mL，低压，与 25mm，0.2µm 多孔滤膜配合使用。 移液管：1）20，100 和 1000µL；2）巴斯德移液管，146mm； 小型离心机：可用小型离心管，11000*g； 座式离心机：可用 30mL 的离心管，1000*g； 稀释器：重复分配溶液，精确到±1%； 微型管：聚乙烯，1.5mL，带盖； 试管：塑料，15mL，带螺旋盖； 超声清洗器：带脱气功能； 涡轮混合器。 3 试剂 所有溶液配制剂检测过程中使用的水必须是18MΩDI水（超纯水）。 3.1 磷酸盐缓冲液：0.2M，pH6.0。将22.0g KH2PO4 和6.0g K2HPO4・3H2O溶解在水中， 稀释到 1L，在自动高压灭菌锅中灭菌120℃/30 分钟； 3.2 盐酸溶液：1M，将8.3mL浓 HCl 用水稀释到 1L； 3.3 氢氧化钠溶液：50%，无盐酸盐，密度 1.54kg/L。100g NaOH（≤1% Na2CO3）,加 100mL 水，搅拌至完全溶解。静置约10天，至 Na2CO3 完全沉淀，取上清液，不用时盖紧 盖子；
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3.4 氢氧化钠溶液：1M，用脱除CO2的水将 54mL的3.3溶液稀释至 1L； 3.5 β-半乳糖酶溶液： 2000U/mL， 在磷酸盐缓冲液中悬浮约50000U/g 的β-半乳糖酶 （米 曲霉发酵产生） ， 获得最终活性为2000U/mL 的溶液， 一个单位在 pH4.5/25℃条件下水解 o硝基苯-β-D-半乳糖，生成 o- 硝基苯酚和 D-半乳糖。不用时将悬浮液存放于冰箱，使用前 将悬浮液充分搅拌。在8小时内使用； 3.6 乙腈：LC 级； 3.7 乙腈溶液：20%（v/v），用水将 200mL 乙腈稀释至 1L； 3.8 乙腈溶液：3%（v/v），用水将 30mL 乙腈稀释至 1L； 3.9 醋酸钠：无水醋酸钠，试剂级； 3.10 流动相A：12.5mM NaOH 溶液，无碳酸盐。将使用氦气脱气装置脱气15分钟以上 的2L水装入瓶子，或者将2L水装入吸滤瓶中，在真空状态下超声水浴10分钟。移取1.30mL 50% NaOH 溶液到脱气的水中，不要摇动或混合。使用前继续脱气30分钟； 3.11 流动相B：125mM NaOH 溶液，无碳酸盐。如3.10制备，加13.9mL 50% NaOH溶 液到2L脱气的水中。使用前继续脱气30分钟； 3.12 流动相C：125mM NaOH 溶液（无碳酸盐）和500mM 醋酸钠。在2L脱气的水中 溶解82.04g醋酸钠，经0.2µm滤膜过滤。添加13.9mL 50% NaOH到滤液中。使用前继续脱气 30分钟； 3.13 半乳糖：无水； 3.14 乳糖：一水（103℃稳定）； 3.15 糖标准贮备液： 在103℃下干燥标样半乳糖和乳糖4小时至恒重。 精确称量80mg 半 乳糖（S1），放入容量瓶，用水溶解稀释至刻度（0.8mg 半乳糖/mL）； 精确称取150mg 一水乳糖 （S2′） ， 用同样的方法制备乳糖溶液 （1.425mg 无水乳糖/mL） 。 S2′乘0.95得到无水乳糖重量（S2），补偿乳糖结晶水的重量。 3.16 工作标准溶液：移取S1溶液和S2溶液各5.00mL（WS1），一并放入1L 容量瓶，稀 释至刻度， 重复以上操作， 移取两个溶液各 10.00mL(WS2),15.00mL(WS3)和 20.00mL （WS4） ， 稀释至 1L溶液。见表2： 表2 工作标准液
表3 HPAEC-PAD 分析的稀释因子
食品种类 乳酸饮料 （4-7%GOS） 果浆(14-18% GOS) 奶油冻(4-7% GOS) 橙汁(4-7% GOS) 饼干(7-10% GOS) 谷物(4-7% GOS)
M2(g) 2.5 1.5 2.0 2.5 2.0 1.0
D1a 25 10 4 3 6 5