第三章分子克隆工具酶级
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CC↓TCAGC GGAGT↑CG
同裂酶：识别相同序列的限制酶称为同裂酶。
同序同切酶：识别序列和切割位置都相同
HpaⅡ与MspⅠ识别切割位点为C↓CGG MobⅠ与Sau3AⅠ识别切割位点为↓GATC
同序异切酶：识别序列相同，但切割位点不同
KpnⅠ：GGTAC↓C Acc65Ⅰ：G↓ GTACC
星星活性 在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相 似的序列，这个改变的特殊性称星星活性。 引起星星活性的原因
甘油浓度高（＞5%） 酶过量（＞100 U/µl ） 离子强度低（＜25 mM） pH值过高（＞8.0 ） 加了有机溶剂，如乙醇等
三、限制酶产生的末端
限制酶产生黏性末端 在对称轴5´侧切割底物，DNA双链交错断开产生5´ 突出黏性末端，如 EcoR I；
在3´侧切割，则产生3´突出黏性末端，如Pst I；
限制酶产生平末端 在回文对称轴上同时切割DNA两条链，产生平末 端，如HpaⅠ。
限制酶产生非对称突出末端 当识别序列为非对称序列时，切割的DNA产物的 末端是不同的，如BbvCⅠ的识别切割位点如下：
第三章 分子克隆工具酶
第一节 限制性内切酶 第二节 甲基化酶 第三节 DNA聚合酶 第四节 其他分子克隆工具酶
第一节 限制性内切酶
一、限制与修饰 二、限制酶识别的序列 三、限制酶产生的末端 四、线性DNA末端对酶切的影响 五、酶切反应条件 六、酶切位点的引入
一、限制与修饰
细菌的限制与修饰系统(R/M系统) 由限制酶（限制性核酸内切酶）和修饰酶（甲基 化酶）组成。 R / M系统的作用：保护自身的DNA不受切割； 破坏外源DNA使之迅速降解。 λ噬菌体在不同宿主中的转染频率。（见p17） 实验说明：K菌株和B菌株中存在一种限制作 用，可排除外来的DNA.
位点偏爱(site preference) 某些限制酶对不同位置的同一识别序列表现出不同 的切割效率，这种现象称作位点偏爱。
pBR322质粒上有4个NarⅠ位点，在标准条件下1单 位NarⅠ可在1h内将2个位点完全切割，但另外2个位 点在50单位16h内也不能切割完全。
造成位点偏爱的原因
在切割DNA之前需要同时与2个识别位点作用； 在要切割的DNA序列上有两个明显不同的结合位点， 其中一个是为DNA切割时激活另一个的变构位点。
限制性核酸内切酶(restriction endonuclease)是一类 能识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并使每条链 的一个磷酸二酯键断开的脱氧核糖核酸内切酶。 限制酶的生物学功能
用来保护宿主不受外来DNA的感染，可降解外来的 DNA，从而阻止其复制和整合到细胞中。
限制酶的种类 Βιβλιοθήκη Baidu型酶 (种类很少，只占1%)
“同工多位”酶：识别简并序列的限制酶包含了另一种限制 酶的功能。
EcoR I：G↓AATTC
Apo I: R↓AATTY (R=A/G Y=C/T)
同尾酶 可产生相同的黏性突出末端的酶统称为同尾酶。 同尾酶切割DNA得到的产物可进行互补连接。
EcoRⅠ： G↓AATTC Apo I: R↓AATTY Mfe I: C↓AATTC
限制酶的命名原则 第1个字母：大写，来自微生物属名第1个字母 第2和3字母：小写，来自微生物种名前两个字母 其它字母：大写或小写，来自微生物菌株号 罗马数字：该菌株发现的限制酶的编号 例：EcoR I 来源于Escheria coli RY13的第一个限制 酶，其识别序列为：GAATTC；
二、限制酶识别的序列
稀切酶
有较长的识别序列和富含GC或AT的识别序列的限制酶称 为稀切酶。 在基因操作中使用稀切酶可以获得大的片段。
四、线性DNA末端对酶切的影响
DNA末端长度的影响 限制酶切割DNA时，识别序列两端必须有一定数 量的核苷酸，否则难以发挥切割活性。 一般在识别序列末端有3 ~ 4个碱基对时能满足常 规的酶切需要。
限制酶降解外源 DNA，维护宿主遗 传稳定的保护机制
识别自身遗传 物质和外来遗 传物质
A→N6-MeA C→5'-MeC
限制酶的发现
美国约翰.霍布金斯大学的H.Smith于1970年偶然发现，流感 嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)能迅速降解外源的噬菌体 DNA，其细胞提取液可降解E.coli DNA，但不能降解自身 DNA，从而找到Hind II限制性内切酶。
三亚基双功能酶，分子量较大，反应需Mg2+、ATP 有特异识别位点但没有特异切割位点
Ⅱ型酶 (占90%以上)
分子量较小，反应只需Mg2+； 识别位点是一个回文对称结构，切割位点在回文对 称结构上； 多数Ⅱ型酶切割DNA后形成粘性末端
Ⅲ型酶 (种类更少，不到1%)
二亚基双功能酶，能识别特定顺序，在该顺序的3’ 端24~26 bp处切开DNA，切割位点没有特异性。
五、酶切反应条件
缓冲液 包括Tris-HCl、Mg2+、DTT、BSA(小牛血清蛋白)
限制酶缓冲液按离子强度的差异分为高、中、低3 种类型
H Buffer (100 mM NaCl)； M Buffer (50 mM)； L Buffer (0 mM)
反应温度：大多数为37 ℃ 反应时间：通常为1h或更多 终止酶切的方法： 10 mM EDTA；加热失活；苯酚抽提除去蛋白质
识别序列的长度 一般为4~8个碱基，最常见的为6个碱基.
4 bp识别序列：Sau3AI ↓GATC 5 bp识别序列：EcoRⅡ ↓CCWGG (W=A/T) 6 bp识别序列：EcoRⅠ G↓AATTC 7 bp识别序列：BbvCI CC↓TCAGC 8 bp识别序列：NotI GC↓GGCCGC
当DNA中可识别的序列在完全随机的情况下：
识别序列为4个碱基时，平均每256个(44)碱基中会出 现一个识别位点；
识别序列为6个碱基时，平均每4096个(46)碱基中会 出现一个识别位点。
识别序列的结构 大多数为回文对称结构，切割位点在DNA两条链 相对称的位置。
限制酶切割的位置 大多数在识别序列的内部，如EcoRI、SmaI等； 但也有在外部的：有两端、两侧和单侧之分，如 Sau3AI (↓GATC)。
同裂酶：识别相同序列的限制酶称为同裂酶。
同序同切酶：识别序列和切割位置都相同
HpaⅡ与MspⅠ识别切割位点为C↓CGG MobⅠ与Sau3AⅠ识别切割位点为↓GATC
同序异切酶：识别序列相同，但切割位点不同
KpnⅠ：GGTAC↓C Acc65Ⅰ：G↓ GTACC
星星活性 在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相 似的序列，这个改变的特殊性称星星活性。 引起星星活性的原因
甘油浓度高（＞5%） 酶过量（＞100 U/µl ） 离子强度低（＜25 mM） pH值过高（＞8.0 ） 加了有机溶剂，如乙醇等
三、限制酶产生的末端
限制酶产生黏性末端 在对称轴5´侧切割底物，DNA双链交错断开产生5´ 突出黏性末端，如 EcoR I；
在3´侧切割，则产生3´突出黏性末端，如Pst I；
限制酶产生平末端 在回文对称轴上同时切割DNA两条链，产生平末 端，如HpaⅠ。
限制酶产生非对称突出末端 当识别序列为非对称序列时，切割的DNA产物的 末端是不同的，如BbvCⅠ的识别切割位点如下：
第三章 分子克隆工具酶
第一节 限制性内切酶 第二节 甲基化酶 第三节 DNA聚合酶 第四节 其他分子克隆工具酶
第一节 限制性内切酶
一、限制与修饰 二、限制酶识别的序列 三、限制酶产生的末端 四、线性DNA末端对酶切的影响 五、酶切反应条件 六、酶切位点的引入
一、限制与修饰
细菌的限制与修饰系统(R/M系统) 由限制酶（限制性核酸内切酶）和修饰酶（甲基 化酶）组成。 R / M系统的作用：保护自身的DNA不受切割； 破坏外源DNA使之迅速降解。 λ噬菌体在不同宿主中的转染频率。（见p17） 实验说明：K菌株和B菌株中存在一种限制作 用，可排除外来的DNA.
位点偏爱(site preference) 某些限制酶对不同位置的同一识别序列表现出不同 的切割效率，这种现象称作位点偏爱。
pBR322质粒上有4个NarⅠ位点，在标准条件下1单 位NarⅠ可在1h内将2个位点完全切割，但另外2个位 点在50单位16h内也不能切割完全。
造成位点偏爱的原因
在切割DNA之前需要同时与2个识别位点作用； 在要切割的DNA序列上有两个明显不同的结合位点， 其中一个是为DNA切割时激活另一个的变构位点。
限制性核酸内切酶(restriction endonuclease)是一类 能识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并使每条链 的一个磷酸二酯键断开的脱氧核糖核酸内切酶。 限制酶的生物学功能
用来保护宿主不受外来DNA的感染，可降解外来的 DNA，从而阻止其复制和整合到细胞中。
限制酶的种类 Βιβλιοθήκη Baidu型酶 (种类很少，只占1%)
“同工多位”酶：识别简并序列的限制酶包含了另一种限制 酶的功能。
EcoR I：G↓AATTC
Apo I: R↓AATTY (R=A/G Y=C/T)
同尾酶 可产生相同的黏性突出末端的酶统称为同尾酶。 同尾酶切割DNA得到的产物可进行互补连接。
EcoRⅠ： G↓AATTC Apo I: R↓AATTY Mfe I: C↓AATTC
限制酶的命名原则 第1个字母：大写，来自微生物属名第1个字母 第2和3字母：小写，来自微生物种名前两个字母 其它字母：大写或小写，来自微生物菌株号 罗马数字：该菌株发现的限制酶的编号 例：EcoR I 来源于Escheria coli RY13的第一个限制 酶，其识别序列为：GAATTC；
二、限制酶识别的序列
稀切酶
有较长的识别序列和富含GC或AT的识别序列的限制酶称 为稀切酶。 在基因操作中使用稀切酶可以获得大的片段。
四、线性DNA末端对酶切的影响
DNA末端长度的影响 限制酶切割DNA时，识别序列两端必须有一定数 量的核苷酸，否则难以发挥切割活性。 一般在识别序列末端有3 ~ 4个碱基对时能满足常 规的酶切需要。
限制酶降解外源 DNA，维护宿主遗 传稳定的保护机制
识别自身遗传 物质和外来遗 传物质
A→N6-MeA C→5'-MeC
限制酶的发现
美国约翰.霍布金斯大学的H.Smith于1970年偶然发现，流感 嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)能迅速降解外源的噬菌体 DNA，其细胞提取液可降解E.coli DNA，但不能降解自身 DNA，从而找到Hind II限制性内切酶。
三亚基双功能酶，分子量较大，反应需Mg2+、ATP 有特异识别位点但没有特异切割位点
Ⅱ型酶 (占90%以上)
分子量较小，反应只需Mg2+； 识别位点是一个回文对称结构，切割位点在回文对 称结构上； 多数Ⅱ型酶切割DNA后形成粘性末端
Ⅲ型酶 (种类更少，不到1%)
二亚基双功能酶，能识别特定顺序，在该顺序的3’ 端24~26 bp处切开DNA，切割位点没有特异性。
五、酶切反应条件
缓冲液 包括Tris-HCl、Mg2+、DTT、BSA(小牛血清蛋白)
限制酶缓冲液按离子强度的差异分为高、中、低3 种类型
H Buffer (100 mM NaCl)； M Buffer (50 mM)； L Buffer (0 mM)
反应温度：大多数为37 ℃ 反应时间：通常为1h或更多 终止酶切的方法： 10 mM EDTA；加热失活；苯酚抽提除去蛋白质
识别序列的长度 一般为4~8个碱基，最常见的为6个碱基.
4 bp识别序列：Sau3AI ↓GATC 5 bp识别序列：EcoRⅡ ↓CCWGG (W=A/T) 6 bp识别序列：EcoRⅠ G↓AATTC 7 bp识别序列：BbvCI CC↓TCAGC 8 bp识别序列：NotI GC↓GGCCGC
当DNA中可识别的序列在完全随机的情况下：
识别序列为4个碱基时，平均每256个(44)碱基中会出 现一个识别位点；
识别序列为6个碱基时，平均每4096个(46)碱基中会 出现一个识别位点。
识别序列的结构 大多数为回文对称结构，切割位点在DNA两条链 相对称的位置。
限制酶切割的位置 大多数在识别序列的内部，如EcoRI、SmaI等； 但也有在外部的：有两端、两侧和单侧之分，如 Sau3AI (↓GATC)。