分子技术在食品乳酸菌分类和鉴定中的应用

分子技术在食品乳酸菌分类和鉴定中的应用

近年来,乳酸菌的各种菌株用于多种食品和益生产品。由于乳酸菌的益生功效为菌株依赖性,而单纯采用表型鉴定方法都无法准确鉴别到种属水平。而基于DNA的基因型鉴定技术,因其检测的准确、稳定和灵敏可以实现乳酸菌种属甚至菌株水平的分类和鉴别。本文对目前的主要分子技术在乳酸菌菌株分类和鉴定中

的应用做一综述。

标签：

乳酸菌;益生菌;鉴定;食品;分子技术

随着人们生活品质的提高,人们广泛关注益生菌食品。益生菌是指一类活的,摄入足够量就可以通过改善肠道微生态平衡而促进人体健康的微生物。目前益生菌中应用较多的是乳杆菌和双歧杆菌。益生菌功效主要集中在维持和调节机体的正常肠道菌群上并由此产生一系列的益生作用,但其益生功效为菌株依赖性。由中国疾控中心营养与食品安全所牵头的研究结果证实,含有B益畅菌(即双歧杆菌DN173010)的酸奶能缩短肠道传输时间,对肠易激综合征人群、便秘人群的胃肠道有明显的改善效果。由于不同菌株改善肠道的机制不同,所以对乳酸菌在菌株水平的鉴定就至关重要。传统的表型法鉴定主要建立在形态学及生理生化特征基础上,但因其种间生化性状相似,单纯使用该法往往无法准确区分各个种。随着分子标记技术的发展,基因型鉴定法以核酸为检测对象,因其更加灵敏和准确而被国内

外学者用于乳酸菌的鉴定。

1 乳酸菌

乳酸菌是存在于人体内的益身菌。按照生化分类法,用于食品中乳酸菌分为5个属:乳秆菌属、双歧杆菌属、链球菌属、明串珠菌属(Leuconostoc)和汁球菌属,每个属包括多种菌种,某些菌种还包括数个亚种。目前益生菌产品中应用较多的是乳杆菌属(Lactobacillaceae L)和双歧杆菌属(Bifidobacteria B)。乳杆菌属中同型发酵乳秆菌包括:德氏乳杆菌(L.delbrueckii)、保加利亚乳杆菌(L.bulgaricus)、瑞士乳秆菌(L.helveticus)、嗜酸乳秆菌(L.acidophilus)和干酪乳杆菌(L.casei);异型发酵乳杆菌包括:短乳秆菌(L.brevis)和发酵乳杆菌(L.fermentum),主要用于发酵工业。双歧杆菌属目前已知的双歧秆菌有24种,而应用于发酵乳制品生产的仅有5种包括:两歧双歧秆菌(B.bifidum)、长双歧杆菌(B.longum)、短双歧秆菌(B.breve)、婴儿双歧秆菌(B.infantis)和青春双歧杆菌(B.adolescentis),它们都存在于人的肠道内。2001年我国卫生部公布的可用于保健食品的益生菌菌种包括:B.bifidum、B.infantis、B.longum、B.breve、B.adolescentis、L.bulgaricus、L.acidophilus、干酪乳杆菌干酪亚种(L.Casei subsp.casei)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)。

而国外用于酸奶及微生物制剂的主要乳酸菌种包括:L.acidophilus、鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)、罗氏乳杆菌(L.rogosae)、植物乳杆菌(L.plantarum)、L.casei、詹氏

乳杆菌(L.jensenii)、B.breve、B.longum、B.bifidum等。

2 乳酸菌的鉴定方法

2.1 表型鉴定法

传统上对乳酸菌属的鉴定主要根据菌体成分或代谢产物在同种属间存在的差异,通过测定这些成分的含量进行菌种鉴定,如:乳酸旋光性的测定、乳酸菌含有的醌分析、细胞壁肽聚糖组分和结构分析。这种基于表面受体的特异性和生化特性的检测方法为表型特征鉴定法。由于该方法无法显示菌体基因组信息,不能体现鉴别菌株间的亲缘关系,且其方法自身检测的模糊性,分辨率不高,重复性差,且结果受微生物生长条件的影响等缺点,基于表型特征的培养鉴定方法无法对乳酸

菌进行准确的属或者种甚至菌株水平的鉴定。

2.2 基因型鉴定法

近年来,学者们采用新的分子生物学和分子标记技术迅速而准确的在亚种和菌株水平上对乳酸菌进行鉴别和分类。这种根据菌株之间遗传距离而导致的DNA指纹差异;从分子和基因水平研究和鉴定乳酸菌遗传结构、组成和分类的方法为基因特征鉴定法。这种以DNA为基础的主要检测技术有:随机扩增多态性DNA (randomly amplified polymorphic DNARAPD)指纹图谱、限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphismRFLP)、扩增片段长度多态性(Amplification fragment length polymorphismAFLP)、脉冲琼脂凝胶电泳(Pulse field gelelectrophoresisPFGE)、扩增性rDNA限制性酶切片段分析(amplified ribosomal DNA restriction analysis,ARDRA)。

2.2.1 16SrDNA/rRNA序列分析:从属到种的鉴定

对生物大分子演变的研究是研究物种的近缘关系的很好工具。16S rDNA或16S rRNA既具有保守性,又具有高变性,为细菌多态性研究最常用的靶基因。Sul 等依据L.acidophilus、L.rhamnosus、B.longum、B.bifidum四种菌的16S rRNA、23S rRNA和16S-23S间区设计引物,快速准确的在属和种水平对四种乳酸菌进行鉴定。

2.2.2 脉冲琼脂凝胶电泳(PFGE)

PFGE可用于乳酸菌的培养鉴定,乳酸菌包埋于琼脂块中,用适当的内切酶在原位对整个染色体进行酶切,酶切片段在特定的电泳系统中通过电场方向不断交替变换及合适的脉冲时间等条件下而得到良好的分离。PFGE中内切酶的选用至关重要,所采用的内切酶常为寡切点酶(low frequency cleavagerestric-tionendoucleases),这种酶切后的片段少而大,适合于作PFGE电泳。该方法是在全基因组水平的分析,能对菌株的突变进行检测(DNA缺失,插入或重组),分辨率高。已有多位学者利用该技术进行中水平的鉴别:B longum和B.animalis;L casei 和L.rhamnosus;Lacidophilus 和L.helveticus;Lb.johnsonii。

2.2.3 随机扩增多态性DNA指纹图谱(RAPD)

RAPD技术是1990年由Wiliam和Welsh等人利用PCR技术发展的检测DNA 多态性的方法。利用随机引物(一般为8—10bp)通过PCR反应非定点扩增DNA 片段,然后用凝胶电泳分析扩增产物DNA片段的多态性。扩增片段多态性便反映了基因组相应区域的DNA多态性。RAPD可用于对整个基因组DNA进行多态性检测,也可用于构建基因组指纹图谱,具有种属甚至种间特异性。与RFLP相比,RAPD技术简单,检测速度快;分析只需少量DNA样品且一套引物可用于不同生物基因组分析。但是,由于该方法存在共迁移问题且该技术影响因素多,凝胶电泳只能分开不同长度DNA片段,而不能分开那些分子量相同但碱基序列组成不同的DNA片段,实验的稳定性和重复性差。所以该技术通常与其他技术联用:Spano G等利用RAPD结合物种特异性PCR技术对红葡萄酒中L plantarum进行种水平的鉴定。Schillinger U等采用L.casei 和L.acidophilus的种属特异性引物,结合RAPD-PCR分析,鉴别出益生菌酸奶中分离的20株乳酸菌,结果与标准菌株图谱对照,证明此法能实现乳酸菌的菌株水平的鉴别。

2.2.4 限制性片段长度多态性(RFLP)

1974年Grodzicker等创立了限制性片段长度多态性(RFLP)技术,它是一种以DNA—DNA杂交为基础的第一代遗传标记。采用特定的限制性内切酶识别并切割不同生物个体的基因组DNA,得到大小不等的DNA片段,所产生的DNA数目和各个片段的长度反映了DNA分子上不同酶切位点的分布情况。通过凝胶电泳分析这些片段,就形成不同带,然后与克隆DNA探针进行Southern杂交和放射显影,即获得反映个体特异性的RFLP图谱。它所代表的是基因组DNA在限制性内切酶消化后产生片段在长度上差异。该技术用于乳酸菌菌株种内水平鉴定的DNA指纹法。Randazzo CL等结合PCR和RFLP技术从自然发酵的橄榄油中分离的35个同型发酵乳杆菌菌株中,分离出24个L casei,11 L plantarum.。该方法具有RFLP标记位点数量不受限制的特点,但是克隆可表现基因组DNA多态性的探针较为困难;另外,该方法操作繁锁,且检测周期长检测成本高。

2.2.5 扩增片段长度多态性(AFLP)