抗肿瘤药效评价

对于假阳性问题，现在 有用人的实体瘤细胞接种在 裸鼠上，进行实验来加以克 服。
几种常用的动物移植性肿瘤
• 小鼠白血病L1210 • 大鼠Walker-256瘤 • Lewis肺癌
白血病L1210是在1948年用甲基胆蒽 DBA/2小鼠诱发所得，它是一种能在 DBA/2小鼠及其杂交一代BDF1和CDF1 小鼠上生长的淋巴性白血病，是动物实 验治疗中最为常用的一种肿瘤模型，在 小鼠白血病1210的实验治疗中，将1× 105个腹水细胞接种在BDFl或CDFl小鼠 腹腔内。在接种后24h开始给药治疗，实 验结束后比较对照组与实验组的小鼠平 均存活时间，即可判断药物的疗效。
2. 生物反应调节剂的药效学评价 生物反应调节剂(biological response modifiers，BRM)是一类能单独或与化疗 药物同时应用，有助于提高化疗效果，减 低化疗药毒副反应的药物。这类药物主要 出自植物和微生物，其作用机理大多是调 节机体的免疫功能。
生物反应调节剂动物实验的特点： • 生物反应调节剂以口服剂型为主。 • 用药时间长。凡经口服给药者，服药期一般 为15~30d。 • 对实验动物的要求也较高，多推荐使用近交 系小鼠。 • 本类药物毒性大多较低，LD50常不能求出， 选用MTD并参考临床用量为给药剂量的依据。
SRB法的基本原理： SRB(sulforhodamine B)是一种蛋白质结合 染料，粉红色，可溶于水。 SRB可与生物 大分子中的碱性氨基酸结合。其在515nm 波长的OD读数与细胞数呈良好的线性关 系。故可用作细胞数的定量。MTT法的一 个缺点是OD值可随放置时间而变，而 SRB法无此现象。因此更适用于进行大规 模的试验。
原理：依据体细胞突变学说，化学致癌物通过对 DNA的攻击而导致细胞癌变。化学致癌物造成 的DNA损伤有三种主要类型：碱基损伤、链断 裂和交链形成。这三种损伤均可引起细胞启动其 修复过程而进行DNA修复。DNA损伤的修复过 程十分复杂，对不同的阶段有不同的检测方法。 一般习惯上把放射性自显影及液体闪烁计数法显 示的非半保留复制的抑制称为非程序DNA合成 抑制试验。
集落形成法的基本原理： 克隆原细胞具有持续增殖能力，当 单个细胞分裂6代或6代以上时，其后代 所组成的群体(集落)便含50个以上细胞。 通过集落计数可对克隆原细胞作定量分 析。它反映了单个细胞的增殖潜力，故 能较灵敏地测定抗癌药的活性，日前被 认为是一种较理想的检测方法。常用的 集落形成法可分为贴壁法及半固体培养 法两种。
操作步骤: 1．选用对数生长期的贴壁肿瘤细胞，用胰 酶消化后，用含10％小牛血清的RPMI l640 培养基配成5000个／ml的细胞悬液，接种在 96孔培养板中，每孔接种200μl，37℃，5％ CO2 培养24h 2. 实验组换新的含不同浓度被测样品的培 养基，对照组则换含等体积溶剂的培养基， 每组设3~5平行孔，37℃，5％CO2 培养4~5 d
生物反应调节剂用于体内抗癌试验 的方法，与细胞毒类药物基本一致，但 需注意以下几点差异： • 给药时间：细胞毒类药物一般在肿瘤接 种后24h开始给药，而本类药物开始给药 的时间和结束时间可以有多种设计，根 据目的不同较为灵活。 • 肿瘤细胞接种量 ：一般比பைடு நூலகம்胞毒类药物 低一个数量级，多在1×104~5 个瘤细胞。
抗肿瘤药的药效学研究
抗肿瘤药的药效学研究
• • • • • • •
抗肿瘤药根据其作用原理大致 可以分为以下几类： 细胞毒性药 生物反应调节剂 分化诱导剂 化学预防药 逆转肿痛耐药性药物 抗肿瘤侵袭、转移药物的实验方法 放疗及化疗增效剂
1. 细胞毒性药的药效学研究
这类药可以通过体外和体内两种方法来 评价其疗效： • 体外常用的方法：、噻唑蓝实验法 (MTT法)、染料排斥试验、生长曲线 法、集落形成法、SRB法 • 体内常用的方法：动物移植性肿瘤实 验法
抗肿瘤侵袭与转移药的评价可以通 过动物实验和体外细胞培养两种方 法进行。
MTT法的基本原理： 四氮唑[MTT,3-(4,5dimethylibiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide]是一种能接受氢原子的染料。活细胞 线粒体中与NADP相关的脱氢酶在细胞内可将 黄色的MTT转化成不溶性的蓝紫色的甲[月替] (formazan)，而死的细胞则无此功能。用二甲 基亚讽(DMSO)溶解甲[月替]后，在一定波长下 用酶标仪测定光密度值，即可定量测出细胞的 存活率。
6. 抗肿瘤侵袭、转移药物的药效学评价 肿瘤转移的基本步骤： • 原发瘤增殖，肿瘤新血管生成。 • 肿瘤细胞侵袭毗邻的基底膜、基质和正常细胞。 • 瘤细胞穿入血管或淋巴管并在循环系统中存活。 • 瘤细胞栓塞、滞留于远隔靶器官的微血管中并 增殖。 • 瘤细胞穿出血管或淋巴管，在靶器官内形成微 转移处。 • 肿瘤问质内新血管生成，转移瘤快速生长。
4. 化学预防药的药效学评价 癌的发生和发展是一个多阶段过程， 一般要经历始发突变、促癌和演变三个 阶段。根据癌变的多阶段理论及预防药 物作用的时间顺序，化学预防药物可分 为三类：抗始发剂(antiinitiator)、抗促 癌剂(antipromotor)和抗演进剂 (antiprogressor)
5. 逆转肿瘤耐药性药物的药效学评价 肿瘤细胞耐药表型和机制 肿瘤细胞耐药性按耐药性来源可分为 内在耐药和获得性耐药，按耐药表型(即 对一种或同时对多种结构和作用机制不同 的药物发生耐药)来分，可分为原药性和 多药耐药性两种。
体外细胞培养的方法
• 建立耐药的肿瘤细胞株： 例如可以用逐步增 加培养基中阿霉素浓度的方法，诱导出一株 耐阿霉素的人源性白血病细胞系。 • 缺定剂量：测定被检测药物在敏感细胞株和 耐药细胞株的细胞毒性，用无毒剂量或小于 IC10的剂量进行试验。 • 测定细胞存活率：多采用MTT法。求出各试 验组存活率(或抑制率)，效果评价用逆转倍 数(FR)： FR=IC50（不加逆转剂）/ IC50 （加逆转剂）
3．弃去上清液，每孔加入200 μl新鲜配制 的含0.2mg／ml MTT的无血清培养 基．37℃继续培养4h。小心弃上清，并加 入200 μl DMSO，用微型超声振荡器混匀 后，在酶标仪上以试验波长为570nm，参 比波长为450nm测定光密度值。
结果评定: 按下式计算药物对肿瘤细胞生长的抑制率： 肿瘤细胞生长抑制率％＝(1-OD实验/OD对照) ×100％ 以同一样品的不同浓度对肿瘤细胞生长抑制 率作图可得到剂量反应曲线，从中求出样品的 半数杀伤浓度IC50。合成化合物或植物提取纯 品的IC50＜10 μg／m1或植物粗提物的IC50＜20 μg／m1时，则判断样品在体外对肿瘤细胞有杀 伤作用。
动物移植性肿瘤实验法 大多数肿瘤化疗药物都是经过动物移植 性肿瘤试验而被发现的，因此动物移植性肿 瘤实验法是筛选新药中最通用的方法。
其优点是 • 肿瘤生长均匀，个体差异小。 • 接种成功率高，可达100％。 • 对宿主的影响也类似，易于客观判断 疗效。 • 动物移植性肿瘤可在同种或同品系动 物中连续移植，长期保留，以供实验 用。实验周期较短。
常用的细胞分化诱导研究方法： • 细胞形态学及组织化学研究方法 • 细胞功能的研究方法：如吞噬功能测定、血 红蛋白(Hb)含量测定、黑色素含量测定、甲 胎蛋白(AFP)和白蛋白(Alb)分泌量的测定、细 胞增殖能力测定等。 • 与分化有关的基因及其表达的研究方法：癌 基因是一类主要的增殖分化调控因素。几乎 所有增殖旺盛的细胞均有myc表达，c-fos是一 种分化标志，检测这些基因的表达可以反映 细胞的分化情况。
抗Ames试验 • Ames试验或称鼠伤寒沙门氏菌回复突 变试验，是一种经济、敏感和应用广泛 的检测原核生物基因突变的方法。 • 原理：利用沙门氏菌(S.typhimurium)的 遗传基因突变性质，以组氨酸要求性的 变异(his-—his+)为指标，当这些菌株欠 缺DNA损伤的修复功能时，对多种致突 变物质具有很高的敏感性。一般通用的 菌株是TA97、TA98、TA100和TAl02。
非程序DNA合成抑制实验 非程序DNA合成(UDS)是指发生在S期 以外的与DNA损伤有关的一种DNA合成。 它可以通过同位素标记的特异前体(常用 3H—胸腺嘧啶核苷)参入DNA而显示。UDS 是目前公认的检测真核细胞基因突变或损 伤修复的有效而经济的一种方法，在当前 被用于研究受试物质的抗始发突变作用。
染料排斥试验的基本原理： 活细胞有排斥某些染料如伊红、台盼蓝、 苯胺黑等的能力，而死细胞由于膜完整性 的破坏，可被着色。因此培养的肿瘤细胞 中加入这些染料，一定时间后，对着色和 未着色的细胞进行计数，即可算出被杀死 的细胞比例。
生长曲线法的基本原理： 在最适条件下，肿瘤细胞在培养液中呈 指数生长，如取细胞数的对数与培养时间作 图可得一条直线，故称此时为对数生长期。 随着细胞密度不断增高，由于代谢产物的积 聚及营养物的消耗，细胞生长逐渐减慢以致 停止，此时称高坪期或稳定期。因此药物对 细胞生长的影响可通过生长曲线反映出来。
• 疗程 ：给药期一般比细胞毒类药物长。 • 一些有抑瘤作用的BRM类药物，除作 肿瘤疗效的筛选外，还需作数项免疫 功能测定指标。
3. 分化诱导剂的药效学评价 肿瘤是一种分化阻止或分化缺陷病， 采用某种手段克服这种分化缺陷就可使分 化受阻的恶性细胞向正常分化。分化诱导 剂就是使恶性肿瘤细胞分化成较成熟的细 胞，使之自然死亡，而不是通过杀伤的作 用来治疗恶性肿瘤的一类药物。
Walker—256瘤是1928年在一个怀孕大白 鼠的乳腺部位自发产生。接种在皮下或肌肉 内成为实体瘤，接种在腹腔则成为腹水瘤。 在接种后第3d开始给药治疗，实验结束后比 较对照组与实验组的瘤重或大鼠平均存活时 间，即可判断药物的疗效。
Lewis肺癌是1951年在一个C57BL／6小鼠上 发现的自发性肺内的未分化的上皮样癌。该瘤在 传代中生长迅速，很快见有出血，并在同系小鼠 移植时有很高的成活率(约98％)。且恶性程度较 高，皮下、肌肉接种对药物的敏感性较低，但可 向肺转移，特别是静脉接种时。可在肺形成瘤集 落，此模型也可用于抗转移的实验研究在接种后 第l天开始结药治疗。实验结束后比较对照组与 实验组的瘤重，即可判断药物的疗效。