第5章分子发光
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分子发光分析法
1, 无辐射去激
不伴随发光现象的过程叫无辐射去激, 不伴随发光现象的过程叫无辐射去激,体 系内的多余的能量以热的形式释放
(1)内部转换(IC,Internal Conversion) 内部转换(IC, Conversion) 两个电子能级非常靠近以至其振动能级有重叠时 非常靠近以至其振动能级有重叠 当两个电子能级非常靠近以至其振动能级有重叠时, 相同的多重态之间的转换, 相同的多重态之间的转换,S2 → S1,T2-T1 (2)振动驰豫(VR,Vibrational Relaxation) 振动驰豫(VR, Relaxation) 同一电子能级中 同一电子能级中,从较高振动能级到较低振动能级 的过程.速率极大, 完成. 的过程.速率极大, 10-14 ~ 10-12s 完成.
分子发光分析法
Molecular luminescence analysis
§ 5- 1 概述
一,分子发光分析法及其分类 某些物质的分子吸收一定能量后, 某些物质的分子吸收一定能量后,电子从基态跃 迁到激发态,以光辐射的形式从激发态回到基态, 迁到激发态,以光辐射的形式从激发态回到基态, 分子发光, 这种现象称为分子发光 这种现象称为分子发光,在此基础上建立起来的 分析方法为分子发光分析法
VR S2 IC VR S1 ISC
VR:振动驰豫 : IC:内部转换 : ISC:系间窜跃 : VR T1
S0 吸光 吸光 荧光 磷光
S0
分子荧光, 图5-1 分子荧光,磷光光谱产生过程示意图
内转换 S2 S1 能 量 吸 收
内转换 振动弛豫 系间跨越
T1 发 射 荧 光
T2
外转换
发 射 磷 振动弛豫 光
620
3.激发光谱与发射光谱的关系 3.激发光谱与发射光谱的关系
分子发光—荧光、磷光和化学发光法
第5章分子发光—荧光、磷光和化学发光法(Molecular Emisssion and Luminescence)（3学时）教学目的和要求：1.学会分子发光——荧光、磷光和化学发光原理。
2.了解分子发光——荧光、磷光和化学发光法的特点和应用。
教学要点和所涵盖的知识点：荧光、磷光和化学发光原理、仪器、分析方法及应用重点和难点：荧光的原理、仪器、分析方法及应用。
分子发光：处于基态的分子吸收能量(电、热、化学和光能等)被激发至激发态，然后从不稳定的激发态返回至基态并发射出光子，此种现象称为发光。
发光分析包括荧光、磷光、化学发光、生物发光等。
物质吸收光能后所产生的光辐射称之为荧光和磷光。
第一节荧光分析法一、概述分子荧光分析法是根据物质的分子荧光光谱进行定性，以荧光强度进行定量的一种分析方法。
荧光分析的特点：灵敏度高：视不同物质，检测下限在0.1~0.001μg/mL之间。
可见比UV-Vis 的灵敏度高得多。
选择性好：可同时用激发光谱和荧光发射光谱定性。
结构信息量多：包括物质激发光谱、发射光谱、光强、荧光量子效率、荧光寿命等。
应用不广泛：主要是因为能发荧光的物质不具普遍性、增强荧光的方法有限、外界环境对荧光量子效率影响大、干扰测量的因素较多。
二、基本原理1、分子荧光的产生处于分子基态单重态中的电子对，其自旋方向相反，当其中一个电子被激发时，通常跃迁至第一激发态单重态轨道上，也可能跃迁至能级更高的单重态上。
这种跃迁是符合光谱选律的，如果跃迁至第一激发三重态轨道上，则属于禁阻跃迁。
单重态与三重态的区别在于电子自旋方向不同，激发三重态具有较低能级。
在单重激发态中，两个电子平行自旋，单重态分子具有抗磁性，其激发态的平均寿命大约为10-8s;而三重态分子具有顺磁性，其激发态的平均寿命为10-4~1s以上(通常用S和T分别表示单重态和三重态)。
处于激发态的电子，通常以辐射跃迁方式或无辐射跃迁方式再回到基态。
辐射跃迁主要涉及到荧光、延迟荧光或磷光的发射；无辐射跃迁则是指以热的形式辐射其多余的能量，包括振动弛豫( VR)、内部转移(IR)、系间窜跃(IX)及外部转移(EC)等，各种跃迁方式发生的可能性及程度，与荧光物质本身的结构及激发时的物理和化学环境等因素有关。
仪器分析作业03参考答案(第三、五章紫外可见分光光度法+分子发光分析法)华南理工大学仪器分析
01. 溶液有颜色是因为它吸收了可见光中特定波长范围的光。
若某溶液呈蓝色，它吸收的是什么颜色的光？若溶液无色透明，是否表示它不吸收光？答：溶液呈蓝色，表明其吸收了蓝光的互补光，即黄光（若答是吸收了黄光外的所有可见光，不能说错，但是这样的情况过于巧合，少见！）。
若溶液无色透明，仅能说明其不吸收可见波段的光。
2. 分别在己烷和水中测定某化合物UV-Vis 光谱，发现该化合物的某个吸收峰由285 nm （己烷）蓝移至275 nm （水），（1）判断产生该吸收峰的跃迁类型；（2）试估算该化合物与水生成氢键的强度。
答：（1）溶剂极性增大，λmax 蓝移，表明该吸收峰是由n →π*跃迁产生的。
（2）()()⎪⎪⎭⎫⎝⎛λ-λ⋅⋅=己烷氢键max O H max A 11hc N E 2 ⎪⎭⎫ ⎝⎛⨯⨯⨯⨯⨯⨯⨯⨯=--99834-23102851-102751100.31063.61002.61mol J 28.15-⋅=3. 按从小到大顺序对下列化合物的λmax 排序，并简单说明理由（不要想得太复杂）A. NO 2B. NO 2t-C 4H 9t-C 4H 9 C.NO 2CH 3 D. NO 2C 2H 5答：B<D<C<A （空间位阻依次减小，共轭程度依次增加，λmax 红移）4. 某化合物分子式为C 10H 16，用其他仪器方法已经证明有双键和异丙基存在，其紫外光谱λmax =230 nm （ε=9000），1mol 该化合物只能吸收2 mol H 2，加氢后得到1-甲基-4异丙基环己烷，试确定该化合物的可能结构。
答： 1mol 该化合物只能吸收2 mol H 2，且其紫外光谱λmax =230 nm （ε=9000）可知该化合物含两个共轭但非同环双键（同环共轭双键基值为253 nm ）；该化合物含异丙基（双键不会出现在异丙基上），根据加氢后产物结构可推出该化合物可能结构如下：根据Woodward 规则可计算出该化合物的λmax =214+5（环外双键）+5⨯2（烷基取代）=229 nm ，与所测值相符。
chapter5分子磷光和荧光
有不同衍射图
电子衍射：电子衍射是透射电子显微镜的
一、荧光与磷光的产生过程
luminescence process of molecular fluorescence phosphorescence
1. 分子能级与跃迁 分子能级比原子能级复杂； 在每个电子能级上，都存在振动、转动能
级； 基态(S0)→激发态(S1、S2、激发态振动能
级)：吸收特定频率的辐射；量子化；跃迁一 次到位；
2.电子激发态的多重度 电子激发态的多重度：M=2S+1 S为电子自旋量子数的代数和(0或1)； 分子中一对电子为自旋反平行，S=0，M=1，这 种态被称为单重态或单线态，大多数有机分子 的基态处于单重态。 处于S0态的一对电子吸收光子受激后，产生了在 两平个行轨自道旋中比自成旋 方 向 平 行 的 电 子 ， 这 时 S=1 ， M对=自3，旋这稳种定状(态洪称为三重态或三线态。 特规则)，三重 态能级比相应
11. 顺磁共振波谱分析法 在外磁场的作用下，电子的自旋磁矩
与磁场相互作用而裂分为磁量子数不同的 磁能级，吸收微波辐射后产生能级跃迁， 1根2. 据旋吸光收法光谱可进行结构分析。
溶液的旋光性与分子的非对称结构有 密切关系，可利用旋光法研究某些天然产 物及配合物的立体化学问题，旋光计测定 1糖3. 的衍含射量法。 X射线衍射：研究晶体结构，不同晶体具
二、激发光谱与荧光光谱
excitation spectrum and fluore-scence spectrum
三、荧光的产生与分子结构关系
relation between fluorescence and molecular structure
四、影响荧光强度的因素
factor influenced fluorescence
电子衍射：电子衍射是透射电子显微镜的
一、荧光与磷光的产生过程
luminescence process of molecular fluorescence phosphorescence
1. 分子能级与跃迁 分子能级比原子能级复杂； 在每个电子能级上，都存在振动、转动能
级； 基态(S0)→激发态(S1、S2、激发态振动能
级)：吸收特定频率的辐射；量子化；跃迁一 次到位；
2.电子激发态的多重度 电子激发态的多重度：M=2S+1 S为电子自旋量子数的代数和(0或1)； 分子中一对电子为自旋反平行，S=0，M=1，这 种态被称为单重态或单线态，大多数有机分子 的基态处于单重态。 处于S0态的一对电子吸收光子受激后，产生了在 两平个行轨自道旋中比自成旋 方 向 平 行 的 电 子 ， 这 时 S=1 ， M对=自3，旋这稳种定状(态洪称为三重态或三线态。 特规则)，三重 态能级比相应
11. 顺磁共振波谱分析法 在外磁场的作用下，电子的自旋磁矩
与磁场相互作用而裂分为磁量子数不同的 磁能级，吸收微波辐射后产生能级跃迁， 1根2. 据旋吸光收法光谱可进行结构分析。
溶液的旋光性与分子的非对称结构有 密切关系，可利用旋光法研究某些天然产 物及配合物的立体化学问题，旋光计测定 1糖3. 的衍含射量法。 X射线衍射：研究晶体结构，不同晶体具
二、激发光谱与荧光光谱
excitation spectrum and fluore-scence spectrum
三、荧光的产生与分子结构关系
relation between fluorescence and molecular structure
四、影响荧光强度的因素
factor influenced fluorescence
第五章分子发光—荧光、磷光和化学发光法
2.化学发光效率
发射光子的分子数 cl ce em 参加反应的分子数
激发态分子数 化学效率： ce 参加反应分子数
发光效率：
em
产生光子数 激发态分子数
时刻t 的化学发光强度(单位时间发射的光量子数)：
dc I cl t cl dt
dc/dt 分析物参加反应的速率；
目 录
5-1 荧光和磷光光谱法
5-1-1 5-1-2 5-1-3 5-1-4 基本原理 荧光分析仪器 荧光分析方法的特点与应用 磷光分析法
5-2 化学发光与生物发光分析法
5-1-1 基本原理
5-1-1-1 5-1-1-2 5-1-1-3 5-1-1-4 荧光和磷光的产生 光谱曲线 荧光的影响因素 荧光强度的定量关系
5-1-1-4 荧光强度的定量关系
根据Parker方程，荧光强度F与荧光物质的浓度c 之间的关系是：
F 2.3kI 0 Fcl[1 (2.3cl) / 2! (2.3cl) 2 / 3! ]
k 与仪器有关的常数
I0 激发光的强度 F 荧光量子产率 荧光物质在激发波长处的摩尔吸光系数 l 光程长度。
当cl项很小时，括号内第二项及以后的高次项均 可忽略不计，Parker方程可简化为： F 2.3kI 0 Fcl F = Kc
5-1-2 荧光分析仪器
5-1-2-1 荧光分析仪器框图
光源
消除溶液中可能共存的其它 光线的干扰,以获得所需要 的荧光.
显示
激发光单色器
信号处理
I0
样品池 F 发射光单色器 (荧光单色器) 检测器
4.化学发光反应的类型
（1）气相化学发光反应 a. 一氧化氮与O3的发光反应(可测定空气中NO2的含量） NO + O3 → NO2* NO2* → NO2 + h
分子发光
（ 3）基态单重态到激发单重态的激发为允许跃迁，基 态单重态到激发三重态的激发为禁阻跃迁。
（4）激发三重态的能量较激发单重态的能量低。
2、分子能级结构与分子发射光谱
处于激发态的电子，通常以辐射跃迁方式或无辐射
跃迁方式再回到基态。
辐射跃迁：荧光、磷光的发射。 无辐射跃迁：振动弛豫（VR）、内转化（ic）、体系间 窜跃（isc）等。
A
(2.3 A) 2 (2.3 A)3 I f I o [2.3 A ] 2 3
如果吸光度A<0.05, 方括号中其他各项与第一项相比 均可忽略:
I f 2.3 I o A
由于A=bc，故在实验条件固定时，荧光强度与浓
度成正比，即：
I f 2.3I 0 A
抗体、抗原
酶联免疫吸附分析示意 Enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）
2. 荧光与有机化合物结构的关系
（1）跃迁类型 对于大多数荧光物质，首先经历激发，然后经过
振动弛豫或其他无辐射跃迁，再发生 跃迁而得到荧光。
（2）共轭效应 容易实现激发 的芳香族化合物容易发生荧光。 增加体系的共轭度荧光效率将增大，主要是由于增大荧 光物质的摩尔吸光系数，有利于产生更多的激发态分子。
类型 转入三重态猝灭： 溶解氧与荧光物质。 发生电子转移反应猝灭： 猝灭剂与荧光物质。 浓度较高单重激发态的分子在 荧光物质的自猝灭： 发生荧光之前和未激发的荧光 物质分子碰撞而引起的自猝灭。 29
二、荧光分析仪
Cary Eclipse 荧光分光光度计 荧光、磷光化学/生物发光 美国瓦里安技术中国有限公司
抗磁性。
当分子吸收能量后，在跃迁过程中不发生电子自旋方
分析化学-分子发光分析法
3. 流式细胞术（FCM） 对悬液中的单细胞或其他生物粒子,通过检测
标记的荧光信号，实现高速、逐一的细胞定量 分析和分选的技术。
§4 化学发光分析法
Chemiluminescence Analysis
基本原理 化学发光反应类型 化学发光测量仪器 化学发光分析法的应用
一、基本原理
化学发光是由于化学反应而导致的光发射。 发生于生命体系的化学发光称为生物发光。 生物发光均有酶（荧光素酶）参加。
最大化学发光强度与发光物质浓度成正 比： Icl max = Kc
化学发光的积分值与发光物质浓度成正 比： Icl = Kc
二、化学发光反应的类型
直接化学发光
A 十 B C＊ ， C＊ C 十 hν
间接（敏化）化学发光 A 十 B C＊ + D ， C＊+ F C 十 F＊
F＊ F 十 hν
三、New technique of fluorescence analysis
1. 激光荧光分析 F 与 I0 成正比，激光的强度大，可提高
荧光法的灵敏度。
2.时间分辨荧光分析
由于不同分子的荧光寿命不同，在激发 和检测之间延缓一段时间，使不同荧光寿命 的物质达到分别检测的目的。
时间分辨荧光免疫法 将稀土元素的螯合物标记抗体，与体液中 的抗原结合。当加入一种增效剂时，稀土 元素被释放出来，形成新的螯合物，能产生 长寿命的 荧光（10 ~1000 μs)。待样品中 蛋白质等物质所发荧光完全衰减后进行测定， 可有效消除背景干扰。 已用于测定甲胎蛋白、促性腺绒毛激素、 皮质醇等体内微量物质的测定。
2.化学发光免疫分析仪
化学发光免疫分析是将化学发光分析和 免疫分析相结合而建立的一种超微量分析 技术。兼具发光分析的高灵敏性和抗原抗 体反应的高特异性的特点。
分子发光
(三)荧光的产生与分子结构的关系
1.分子产生荧光必须具备的条件 （1）合适的结构（芳环/多个共轭双键） （2）一定的荧光量子产率 发射的光量子数
吸收的光量子数
一般在0.1－1之间；凡是使荧光增加，使 其它去活化常数降低的因素均可增加荧光量子产 率；荧光强度由分子结构（内因）和所处化学环 境（外因）共同决定
（二）激发光谱与荧光光谱
1 激发光谱 改变激发波长，测量在最强荧（磷）光发射 波长处的强度变化，以激发波长对荧光强度作 图可得到激发光谱 激发光谱形状与吸收光谱形状完全相似，经 校正后二者完全相同！这是因为分子吸收光能 的过程就是分子的激发过程。激发光谱可用于 鉴别荧光物质；在定量时，用于选择最适宜的 激发波长
（二） 磷光的特点 • 磷光波长比荧光的长(T1<S1)������ • 磷光寿命比荧光的长(磷光为禁阻跃迁产生， 速率常数小) • 磷光寿命和强度对重原子和氧敏感
（三）荧光分析法的应用 1 无机化合物的分析 铍、铝、硼、镓、硒、 镁、稀土常采用荧光分 析法
荧光试 剂/探 针
2
生物与有机化合物的分析
3. 室温磷光 低温荧光需低温实验装臵且受到溶剂选择的限制 1）固体基质：在室温下以固体基质（如纤维素等） 吸附磷光体，增加分子刚性、减少三重态猝灭等 非辐射跃迁，从而提高磷光量子效率 2）胶束增稳：利用表面活性剂在临界浓度形成具 多相性的胶束，改变磷光体的微环境、增加定向 约束力，从而减小内转换和碰撞等去活化的几率， 提高三重态的稳定性。利用胶束增稳、重原子效 应和溶液除氧是该法的三要素
2.化合物的结构与荧光
（1）跃迁类型： *→n和*→，后者的荧光效率高 ，系间跨越过程的速率常数小，利于产生荧光 （2）共轭效应：共轭利于增加荧光效率产生红移 （3）刚性平面结构：可降低分子振动，减少与溶剂的 相互碰撞作用，共轭分子共平面性增强，故具有很强 的荧光
第五章 分子发光分析法
s
体系间窜跃（ 不同多重态, 体系间窜跃（ isc ）：不同多重态,有重叠的转动能级间的非辐 射跃迁（ S1→T1跃迁 跃迁） 磷光发射：电子由第一激发三重态 射跃迁（ S1→T1跃迁） 。磷光发射：电子由第一激发三重态 的最低振动能级( =0)跃迁至基态各振动能级 跃迁至基态各振动能级（ T1→S0跃迁 跃迁）。 的最低振动能级(v=0)跃迁至基态各振动能级（ T1→S0跃迁）。 S2 Intersystem Crossing 系间窜跃 S1 磷光发射 Phosphorescence T1
第五章 分子发光分析法
基态分子吸收一定能量后，跃迁至激发态， 基态分子吸收一定能量后，跃迁至激发态，当激 发态分子以辐射跃迁形式将其能量释放返回基态时 分子以辐射跃迁形式将其能量释放返回基态 发态分子以辐射跃迁形式将其能量释放返回基态时， 便产生分子发光 分子发光（ 便产生分子发光（Molecular Luminescence）。 ）。 依据激发的模式不同，分子发光分为光致发光 依据激发的模式不同，分子发光分为光致发光 按激发的类型又可分为荧光和磷光两种）、 荧光和磷光两种）、热致发 （按激发的类型又可分为荧光和磷光两种）、热致发 场致发光和化学发光等 光、场致发光和化学发光等。 本 分子荧光（Molecular Fluorescence）、 分子荧光（ ）、 章 分子磷光（ 分子磷光（Molecular Phosphorescence） ） 化学发光（ 化学发光（Chemiluminescence） ）
S0 λ2 λ1
内转移（ ） 相同多重态的两个电子能级之间 之间（ 内转移（ic） ：相同多重态的两个电子能级之间（如S2 S1,S1 S0）的非辐射跃迁 。 ）
S2 T1 S1
S0 λ2 λ1
5 荧光分析
3. 刚性平面结构
荧光物质的刚性和平面 性增加，有利于荧光发射。
芴 联苯
F=1
F=0.2
-O
O C
O
N N
荧光黄 不产生荧光
产生荧光
偶氮苯
COO-
F=0.92
-O C COOO
N N
偶氮菲
酚酞 产生荧光 不产生荧光
H3C CH3
萘 VA
CH2OH
F(萘)= 5F(VA)
4. 取代基效应
一、分子荧光与磷光的产生
luminescence process of molecular fluorescence phosphorescence
1.单重态与三重态
电子激发态的多重度：M=2S+1 S为电子自旋量子数的代数 和(0或1)； 单重态：全部轨道里的电子都是自旋配对的，S=0,M=1； 三重态：分子具有自旋不配对的电子，S=1,M=3. 平行自旋比成对自旋稳定(洪特规则)，三重态能级比相应单重 态能级低； 大多数有机分子的基态处于单重态；
1
K1 [M*]
M* Q k 2 M Q ΔH K2 [M*] [Q]
共振能量转移：
D* D hv , A hv A*
分子内能量转移：
N
D* ( S1 ) A( S 0 ) D( S 0 ) A* ( S1 ) D* (T1 ) A( S 0 ) D( S 0 ) A* ( S1 )
CH3 CH3
hv
+
_
N
CH3
CH3
（3） 氧的熄灭作用 氧分子是荧光、磷光的熄灭剂，
1
3
M O 2 3 M* 3 O 2
分析化学(仪器分析)第五章 分子发光分析法
给电子基团(-OH, -NH2, -NR2, -OR)使共轭体系增 大，导致荧光增强。反之， 吸电子基团(-COOH, NO, -NO2)使荧光减弱。
“重原子效应”--- 随着卤素取代基原子序数的增 加，物质的荧光减弱，磷光增强的现象。 分子中由于重原子的存在导致容易发生系间 窜跃的效应，产生的原因是原子序数高的重原子 的电子自旋和轨道间的相互作用变大，容易发生 自旋偶合作用，使S1－T1的体系间窜跃显著增加 所致。
23
② 静态猝灭（组成化合物的猝灭） 由于部分荧光物质分子与猝灭剂分子生成非荧光 的配合物而产生的。此过程往往还会引起溶液吸收 光谱的改变。 ③ 转入三重态的猝灭（S1—T1–– S0） 分子由于系间的跨越跃迁，由单重态跃迁到三重 态。转入三重态的分子在常温下不发光，它们在与 其它分子的碰撞中消耗能量而使荧光猝灭。 溶液中的溶解氧对有机化合物的荧光产生猝灭效 应是由于三重态基态的氧分子和单重激发态的荧光 物质分子碰撞，形成了单重激发态的氧分子和三重 态的荧光物质分子，使荧光猝灭。
18
（3）环境因素对荧光的影响
a. 溶剂的影响 电子激发态比基态具有更大的极性， 溶剂的极性增强，对激发态会产生更大的 稳定作用，使荧光波长红移，强度增大。 b. 温度的影响 辐射跃迁的速率不随温度而变，而非 辐射跃迁的速率随温度升高而显著增大。 温度升高，使得非辐射跃迁概率增大。 T增大， φf减小
26
如果 固定激发光波长为其 最大激发波长，然后测定 不同的波长时所发射的荧 光或磷光强度，即可得到 荧光或磷光发射光谱曲线。 荧光强度最大时的波长即 为发射波长λem 激发光谱和荧光光谱是荧 光测定时选择激发波长和 荧光测量波长的依据，也 可以用于鉴别荧光物质
27
激发光谱与发射光谱的关系
“重原子效应”--- 随着卤素取代基原子序数的增 加，物质的荧光减弱，磷光增强的现象。 分子中由于重原子的存在导致容易发生系间 窜跃的效应，产生的原因是原子序数高的重原子 的电子自旋和轨道间的相互作用变大，容易发生 自旋偶合作用，使S1－T1的体系间窜跃显著增加 所致。
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② 静态猝灭（组成化合物的猝灭） 由于部分荧光物质分子与猝灭剂分子生成非荧光 的配合物而产生的。此过程往往还会引起溶液吸收 光谱的改变。 ③ 转入三重态的猝灭（S1—T1–– S0） 分子由于系间的跨越跃迁，由单重态跃迁到三重 态。转入三重态的分子在常温下不发光，它们在与 其它分子的碰撞中消耗能量而使荧光猝灭。 溶液中的溶解氧对有机化合物的荧光产生猝灭效 应是由于三重态基态的氧分子和单重激发态的荧光 物质分子碰撞，形成了单重激发态的氧分子和三重 态的荧光物质分子，使荧光猝灭。
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（3）环境因素对荧光的影响
a. 溶剂的影响 电子激发态比基态具有更大的极性， 溶剂的极性增强，对激发态会产生更大的 稳定作用，使荧光波长红移，强度增大。 b. 温度的影响 辐射跃迁的速率不随温度而变，而非 辐射跃迁的速率随温度升高而显著增大。 温度升高，使得非辐射跃迁概率增大。 T增大， φf减小
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如果 固定激发光波长为其 最大激发波长，然后测定 不同的波长时所发射的荧 光或磷光强度，即可得到 荧光或磷光发射光谱曲线。 荧光强度最大时的波长即 为发射波长λem 激发光谱和荧光光谱是荧 光测定时选择激发波长和 荧光测量波长的依据，也 可以用于鉴别荧光物质
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激发光谱与发射光谱的关系
分子发光分析法
磷光光谱
200 260 320 380 440 500 560 620 室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱
3.激发光谱与发射光谱的关系
a.Stokes位移
激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发射光谱的波长比
激发光谱的长，振动弛豫消耗了能量。
b.发射光谱的形状与激发波长无关
电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量(如能级
非光谱分析法
光谱分析法
折 射 法
圆 二 色 性 法
X 射 线 衍 射 法
干 涉 法
旋 光 法
原子光谱分析法
原 子 吸 收 光 谱
原 子 发 射 光 谱
原 子 荧 光 光 谱
X 射 线 荧 光 光 谱
分子光谱分析法
分分核 紫红子子磁 外外荧磷共 光光光光振 谱谱光光波 法法谱谱谱
法法法
各种光分析法
1. 原子发射光谱分析法 以火焰、电弧、等离子炬等作为光源，使气态原子
反跃迁的几率也越大，即产生的光谱呈镜像对称。
荧光激发光谱
荧光发射光谱
200 250 300 350 400 450 500 nm
蒽的激发光谱和荧光光谱
三、荧光的产生与分子结构的关系
relation between fluorescence and molecular structure
1.分子产生荧光必须具备的条件
（1）具有合适的结构：分子必须具有与所照射的辐射频率相
适应的结构, 才能吸收激发光； （2）具有一定的荧光量子产率。荧光量子产率也叫荧光效率 或量子效率，它表示物质发射荧光的能力，通常用下式表示
荧光量子产率（）： 发射的光量子数
吸收的光量子数
在产生荧光的过程中，涉及到许多辐射和无辐射跃迁过程， 如荧光发射、内转移、系间跨跃和外转移等。因此，荧光的 量子产率，将与上述每一个过程的速率常数有关。 如外转换过程速度快，不出现荧光发射。
第5章荧光法与化学发光法解读.
散射光的影响
瑞利散射光
拉曼散射光
干扰荧光测定，应采取措施消除
30
硫酸奎宁在不同波长激发下的荧光与散射光谱
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5.1.3
荧光分光光度计
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1. 激发光源
高压氙灯 ——强谱线的连续光谱
连续分布在250-700nm波长范围内，尤其是300-400nm波 长之间的谱线强度几乎相等
汞灯 ——线光谱
高压：近紫外区365nm,398nm，405nm，436nm，546nm，579nm 低压:紫外区，最强254nm
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荧光熄灭剂
荧光熄灭是指荧光物质分子与溶剂分子或溶质 分子相互作用引起荧光强度降低的现象。
引起荧光熄灭的物质称为荧光熄灭剂。
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常见的荧光熄灭剂
卤素离子、重金属离子、氧分子、硝基化合物、 重氮化合物、羰基化合物、羧基化合物
Байду номын сангаас
荧光熄灭的形式：
a、碰撞、 b、生成不发光配位化合物 c、荧光物质氧化
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（2）产生荧光的必备条件
强紫外-可见吸收 一定的荧光效率
π→π*跃迁
强吸收带
n →π*跃迁
弱吸收带
存在共轭的π→π*跃迁， φf高，荧光强度大。
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2．影响荧光强度的结构因素
(1)共轭效应 (2)分子的刚性与共平面性 (3)取代基效应
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(1)共轭效应
绝大多数能产生荧光的物质都含有芳香环或杂 环，因为芳香环或杂环分子具有长共轭的 π→π*跃迁。π电子共轭程度越大，荧光强度 （荧光效率）越大，而荧光波长也长移。
5.1.3 荧光分光光度计 5.1.4 分析方法 5.1.5 应用示例
4
5.1.1
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λem>λex 这是由于受激分子通过振动 弛豫而失去转动能，也由于 溶液中溶剂分子与受激分子的 碰撞，也会有能量的损失。因 此，在激发和发射之间产生了 能量损失。
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萘的激发光谱、荧光
和磷光光谱
★荧光发射光谱的形状与激发波长无关 ★镜像规则 通常荧光发射光谱和它的吸收光谱呈镜像对 称关系。 吸收光谱: 第一电子激发态的各振动能层 基态 荧光光谱: 第一电子激发态的最低振动能层
基态中各不同能层
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因此荧光光谱的形状和吸收光谱的形状极 为相似。
芘的苯溶液的吸收光谱和荧光发射光谱
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3、荧光和分子结构的关系 分子产生荧光必须具备两个条件： 分子必须具有与所照射的辐射频率相适应 的结构才能吸收激发光； 吸收了与其本身特征频率相同的能量之后， 必须具有一定的荧光量子产率。
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间接荧光法 间接荧光法常用于某些阴离子如F-、CN-等的
分析，它们可以从某些不发荧光的金属有机配合物中夺取金属离 子，而释放出能发荧光的配位体，从而测定这些阴离子的含量。
催化荧光法 某些反应的产物虽能发生荧光，但反应速度
很慢，荧光微弱，难以测定。 若在某些金属离子的催化作用下，反应将加速进行，利用这 种催化动力学的性质，可以测定金属离子的含量。 铜、铍、铁、钴、锇、银、金、锌、铅、钛、钒、锰、过氧 化氢及氰离子等都曾采用这种方法测定。
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4、溶液的荧光（或磷光）强度 (1)荧光强度与溶液浓度的关系
当入射光强度I0 和l一定时：
If = K c 注意： 当 l c 0.05时才成立
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（2）影响荧光强度的因素 ★ 溶剂对荧光强度的影响
★温度对荧光强度的影响
温度 荧光强度
原因
1.分子的内部能量转化作用,当激发分子接受 额外热能时，有可能使激发能转换为基态的 振动能量，随后迅速振动弛豫而丧失振动能 量。
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★内滤光作用和自吸收现象
溶液中若存在能吸收激发或荧光物质所发射 光能的物质，就会使荧光减弱，这种现象称为 “内滤光作用”。
荧光物质的荧光发射光的短波长的一端与该 物质的吸收光谱的长波长一端有重叠。 在溶液浓度较大时，一部分荧光发射被自身吸 收，产生“自吸收”现象而降低了溶液的荧光强 度。31来自35★ 选择性好
荧光分析法的光谱比较简单，特征性强，而且 有激发光谱和发射光谱，选择的余地大。
★荧光法提供比较多的物理参数
激发光谱、发射光谱、荧光强度、荧光效率、 荧光寿命等多种物理参数。
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2、定量测定方法
★校准曲线法 ★比较法
3、荧光分析法的应用
★无机化合物的分析
待测元素与有机试剂所组成的能发荧光的配合物， 通过检测配合物的荧光强度以测定该元素的含量。这种方法称 为直接荧光法。
S1 S0 T1
图1 单重态及三 重态激发示意图
3
图2 荧光和磷光体系能级图
S0 分子的基态 S1 第一电子激发单重态 S2 第二电子激发单重态 T1 第一电子激发三重态 T2 第二电子激发三重态 υ=0、1、2、3、… 表示基态和激发态的 振动能级
4
处于激发态的分子是很不稳定的， 它可能通过辐射跃迁和无辐射跃迁的形式 去活化(去激发)释放出多余的能量而返回 基态。
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★刚性平面结构
实验发现，多数具有刚性平面结构的有机分子 具有强烈的荧光。
在0.1mol· L-1的NaOH溶液中，荧光黄 荧光效率达0.92，而酚酞却没有荧光。
又如芴与联二苯(左图所示)，由于 芴中的亚甲基使分子的刚性平面增加， 0 导致两者在荧光性质上的显著差别，前 者荧光产率接近于1，后者仅为0.18。 萘与维生素A都具有5个共轭π键(左 图所示)，而前者为平面结构，后者为非 刚性结构，因而前者的荧光强度为后者 的5倍。 = 0.18
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★有机化合物的分析
芳香族化合物具有共轭的不饱和结构，多能发射 荧光，可以直接进行荧光测定。 例如：降肾上腺素经与甲醛缩合而得到强荧光产 物，然后采用荧光显微法可以检测组织切片中含量低 至 10-17g的降肾上腺素。
在生理科学研究工作及医疗工作中，所遇到的分析 对象常常是分子庞大而结构复杂的有机化合物，可以用 荧光分析法进行测定或研究其结构或生理作用机理。 如
维生素、氨基酸和蛋白质、胺类和甾族化合物、酶和辅酶以及各 种药物、毒物和农药等，这些复杂化合物许多均能发射荧光，
在现代的分离技术中，以荧光法作为检测手段，常 可以测定这些物质的低微含量，荧光免疫分析法也是医 39 学研究的一种重要手段。
（3）溶液荧光猝灭
荧光物质分子与溶剂分子或其它溶质分子的相互 作用引起荧光强度降低的现象称为荧光猝灭。 能引起荧光强度降低的物质称为猝灭剂。
★碰撞猝灭 ★静态猝灭（组成化合物的猝灭） ★转入三重态的猝灭 ★发生电子转移反应的猝灭 ★荧光物质的自猝灭
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二、荧光分析仪
激发光源、样品池、单色器、检测器四部分组 成。 为了消除入射光和散射光的影响，荧光的测量 通常在与激发光成直角的方向上进行。
5
(1)振动弛豫(Vibration relaxation，简写VR)—
同一电子能级：
高振动能级
能量以热的 形式发出 10-12s
低振动能级
图2 荧光和磷光体系能级图
6
(2)内部转移(Internal conversion，简写为IC)——
两个电子能级振动能级有重叠时(相同多重态间）
高能级
无辐射跃迁
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(5)磷光发射(Phosphorescence emission,PE)—
激发态的电子
激发三重态
系间跨跃
第一激发三重 态的最低振动 振动弛豫 能级
辐射 10－4～10s 磷光 基态的各振动能级 自旋禁阻 发光速度很慢 外光源照射停止后，磷光 仍可持续一短时间。 磷光波长 λ3 > λ3 λ’2
磷光波长比荧光波长长 10
(6)外部转移(External convertion,EC)—— 激发态分子与溶剂分子或其它溶质分子相互 碰撞，并发生能量转移的过程称为外部转移。
外部转移能 使荧光或磷光 的强度减弱甚 至消失，这种 现象称为猝灭 或熄灭。
11
12
荧光与磷光的根本区别：
荧光 激发单重态最低振动能层基态各振动能层 磷光 激发三重态最低振动能层基态各振动能层
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2、激发光谱和发射光谱 荧光和磷光均属于光致发光，都涉及到两种辐射:
激发光(吸收)
激发光谱
发射光
发射光谱
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（1） 激发光谱
固定测量波长为荧光（或磷光）最大发射波 长，然后改变激发波长，根据所测得的荧光 （磷光）强度与激发光波长的关系，即可绘制 激发光谱曲线。
通过激发光谱曲线，选择——发射荧光(磷 光)强度最大的激发光波长，最佳激发波长常用 λex表示。
(1)量子产率 荧光量子产率也叫荧光效率或量子效率， 它表示物质发射荧光的能力，通常用下式表 示 = 发射荧光分子数 / 激发分子总数 或 = 发射荧光量子数 / 吸收光量子数
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（2）荧光和化合物结构的关系
有机化合物的荧光的
★跃迁类型
较大的摩尔 吸光系数
寿命比n短
n
第一激发单重态 (S1)的最低振动 能级(υ =0)
辐射
10-9 - 10-7s
基态(S0)的各振动能级
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(4)系间跨跃(Intersystem Crossing, ISC)——不同 多重态之间的无辐射跃迁过程，它涉及到受激 发电子自旋状态的改变。
系间跨跃的速度较 慢，经历的时间较长。
S1
T1
S0
第五章 分子发光分析法
Molecular Luminescence Analysis
§1、分子荧光和磷光分析
§2、化学发光分析
1
§1、分子荧光和磷光分析 一、原 理
1、荧光和磷光的产生 处于基态的物质分子吸收了能量而被激发，它 跃迁回基态所发射的电磁辐射，称为荧光和磷 光。
2
现从分子结构理论来讨论荧光和磷光的产生机理: ● 分子中电子的运动状态除了电子所处的能级外，还 包含有电子的多重态，用M=2S+1表示，S为各电子自旋 量子数的代数和 ● 若分子中所有电子都是自旋配对的，则S=0,M=1, 该分子便处于单重态(或叫单重线)，用符号S表示 ● 基态分子吸收能量后，若电子在跃迁过程中，不发 生自旋方向的变化，这时仍然是M=1，分子处于激发的 单重态 ● 如果电子在跃迁过程中伴随着自旋方向的变化，这 时分子中便具有两个自旋不配对的电子，即S=1,M=3， 分子处于激发的三重态，用符号T表示
= 0.92
1
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原因：
这种结构可以减少分子的振动，使 分子与溶剂或其它溶质分子的相互作 用减少，也就减少了碰撞去活的可能 性。
平面结构可以增大分子的吸光截面， 增大摩尔吸光系数，增强荧光强度。
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★ 取代基效应
给电子基团，如-OH、-OR、-CN、-NH2 、 -NR2 等，使荧光增强。
三、分子荧光分析法及其应用
1、荧光分析法的特点 ★ 灵敏度高
荧光分析法的灵敏度比吸光分析法高2～4个数量级， 检测下限在0.1～0.001μg· mL－1之间。
原因：
一、荧光信号是在暗背景下检测的，噪声小， 较微弱的信号也能被检测，且可以高倍放大； 二、荧光强度和激发光强度成正比关系，可以 提高激发光的光强以增大荧光强度。
原因： 产生了p-共轭作用，增强了电子共轭程度， 使最低激发单重态与基态之间的跃迁几率增 大。
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吸电子基团，如-COOH、-NO、-C O、卤素等， 会减弱甚至会猝灭荧光。
卤素取代基随原子序数的增加而荧光降低!
这可能是由所谓“重原子效应”使系间跨越 速率增加所致。