各类生物制品的分离纯化方法
生物大分子的分离纯化（透析、超滤、冷冻干燥）
生物大分子的分离纯化（透析、超滤、冷冻干燥）生物大分子的分离纯化（透析、超滤、冷冻干燥）2. 透析自Thomas Graham 1861年发明透析方法至今已有一百多年。
透析已成为生物化学实验室最简便最常用的分离纯化技术之一。
在生物大分子的制备过程中，除盐、除少量有机溶剂、除去生物小分子杂质和浓缩样品等都要用到透析的技术。
透析只需要使用专用的半透膜即可完成。
通常是将半透膜制成袋状，将生物大分子样品溶液置入袋内，将此透析袋浸入水或缓冲液中，样品溶液中的大分子量的生物大分子被截留在袋内，而盐和小分子物质不断扩散透析到袋外，直到袋内外两边的浓度达到平衡为止。
保留在透析袋内未透析出的样品溶液称为"保留液"，袋（膜）外的溶液称为"渗出液"或"透析液"。
透析的动力是扩散压，扩散压是由横跨膜两边的浓度梯度形成的。
透析的速度反比于膜的厚度，正比于欲透析的小分子溶质在膜内外两边的浓度梯度，还正比于膜的面积和温度，通常是4℃透析，升高温度可加快透析速度。
透析膜可用动物膜和玻璃纸等，但用的最多的还是用纤维素制成的透析膜，目前常用的是美国Union Carbide （联合碳化物公司）和美国光谱医学公司生产的各种尺寸的透析管，截留分子量MwCO（即留在透析袋内的生物大分子的最小分子量，缩写为MwCO）通常为1万左右。
商品透析袋制成管状，其扁平宽度为23 mm～50 mm不等。
为防干裂，出厂时都用10％的甘油处理过，并含有极微量的硫化物、重金属和一些具有紫外吸收的杂质，它们对蛋白质和其它生物活性物质有害，用前必须除去。
可先用50％乙醇煮沸1小时，再依次用50％乙醇、0.01 mol/L碳酸氢钠和0.001 mol/L EDTA溶液洗涤，最后用蒸馏水冲洗即可使用。
实验证明，50％乙醇处理对除去具有紫外吸收的杂质特别有效。
使用后的透析袋洗净后可存于4℃蒸馏水中，若长时间不用，可加少量NaN2，以防长菌。
总结生物药物分离纯化的方法
总结归纳本课程介绍的可用于物质分离纯化的方法，并说出每种方法的原理。
萃取分离法溶剂萃取法原理：利用物质在两种互不相溶的液相中分配特性不同而进行的分离设法使一种溶解于液相的物质传递到另一液相的操作pH影响分配系数-表观分配系数双水相萃取原理：利用生物物质在互不相溶的两水相间分配系数的差异进行分离的过程反胶束萃取原理：表面活性剂溶于非极性溶剂中，并使其浓度超过临界胶束浓度，便会在有机溶剂内形成聚集体，非极性基团在外，极性基团则排列在内，形成一个极性核，此极性核具有溶解极性物质的能力。
当含有此种反胶束的有机溶剂与蛋白质的水溶液接触后，蛋白质及其他亲水性物质能够溶于极性核内部的水中，由于周围的水层和极性基团的保护，蛋白质不与有机溶剂接触，从而不会造成失活。
超临界萃取原理：当气体物质处于其临界温度(Tc)和临界压力(Pc)以上时，不会凝缩为液体，只是密度增大，具有许多特殊的物理化学性质：流体的密度接近于液体的密度,粘度接近于气体；在临界点附近,超临界流体的溶解度对温度和压力的变化非常敏感；固相析出分离法盐析法原理：盐析法是利用各种生物分子在浓盐溶液中溶解度的差异，通过向溶液中引入一定数量的中性盐，使目的物或杂蛋白以沉淀析出，达到纯化目的的方法。
破坏双电层：在高盐溶液中，带大量电荷的盐离子能中和蛋白质表面的电荷，使蛋白质分子之间电排斥作用相互减弱而能相互聚集起来。
破坏水化层：中性盐的亲水性比蛋白质大，盐离子在水中发生水化而使蛋白质脱去了水化膜，暴露出疏水区域，由于疏水区域的相互作用，使其沉淀。
有机溶剂沉淀法原理：1、降低了介质的介电常数，使溶质分子之间的静电引力增加，聚集形成沉淀。
2、水溶性有机溶剂本身的水合作用降低了自由水的浓度，压缩了亲水溶质分子表面原有水化层的厚度，降低了它的亲水性，导致脱水凝集。
等电点沉淀法原理：Pl时分子表面静电荷未零，双电层及水化膜的削弱或破坏，分子间引力增加，溶解度降低。
常与盐析法、有机溶剂沉淀法或其他沉淀剂一起配合使用。
生物大分子分离与纯化技术
生物大分子分离与纯化技术是生物学、生物医学和生物工程领域中非常重要的技术之一。
它可以用于提取和分离生物大分子，从而达到纯化的目的。
本文将着重探讨的原理、方法和应用。
一、原理在生物细胞中，不同的生物大分子有着不同的形态、结构和性质。
为了分离和纯化这些生物大分子，需要利用它们的理化性质差异。
例如，蛋白质可以通过电泳分离，根据电荷、分子量等差异分离出不同的成分；核酸则可以通过浓度梯度离心分离，根据密度差异分离出单独的成分。
还有一些生物大分子，如多肽、糖类、脂质等，可以通过其他特殊方法分离。
二、方法1. 柱层析法柱层析法是中常用的重要方法之一。
它利用固定相（柱子中的树脂）和流动相（洗脱缓冲液）之间的相互作用来分离和纯化生物大分子。
根据固定相和洗脱缓冲液的不同性质，可以选择不同的柱层析方法，例如离子交换层析、凝胶过滤层析和亲和层析等。
2. 电泳法电泳法是基于生物大分子的电荷差异和分子量差异的原理，将不同的生物大分子分离并捕获的技术。
根据电泳介质、运行方式以及电场的不同条件，可以选择不同的电泳方法，如蛋白质电泳、DNA电泳、脂质电泳等。
3. 超滤法超滤法是利用微孔过滤膜的不同截留分子量，将生物大分子按照大小分离纯化的技术。
超滤法分为正压式和负压式，正压式是通过液体压力将生物大分子向膜孔内压缩，从而分离得到小分子；负压式是通过负压将大分子向膜孔内吸附，难以通过的是大分子。
4. 溶剂萃取法溶剂萃取法是将生物大分子从混合物中溶解到特定的有机溶剂中，然后通过反萃取、扩散等工艺，使它在不同相中转移、分离和纯化的方法。
5. 其他方法生物大分子的分离和纯化方法还有一些其他方法，例如磁性珠法、浓缩法、冷冻干燥法等。
三、应用在生物医学、生物工程、食品工业、环境保护和新能源开发等领域中有广泛的应用。
具体来说，1. 生物医学领域生物医学领域的应用主要是分离和纯化蛋白质和多肽类物质，如酶、抗体、激素、血浆蛋白等。
这些物质可以作为药物、诊断试剂、生物治疗的原材料等。
各类生物制品的分离纯化方法
3.DNA药物的用途： 有抗放射作用。
三、糖类药物的分离纯化
糖的分类：
单糖
葡萄糖、果
糖
按分子组 成可分为
双糖
乳糖、蔗糖、 麦芽糖
多糖
淀粉、纤维素、 糖原
（一）单糖及其衍生物的制备
1.提取：单糖易溶于冷水 和温乙醇中，可用水及 50%乙醇提取， 2.提纯：用醋酸铅盐析除 去蛋白质杂质。
（二）多糖的分离与纯化
原理：离心分离时的样品物质通常是 悬浮在某一特定的液相介质中，由此 而形成的固液悬浮体系，将该体系放 入离心机的离心管内，开机后样品物 质做匀速圆周运动，于是就产生了一 个外向离心力。而由于不同颗粒的质 量、密度、大小不同，在同一液相介 质和相同的离心力场下，沉降速度各 不相同，颗粒由大到小沉淀，这样就 会产生分层，从而达到彼此分离。
离心机类型
普通离心机：转速不超过6000转/每分钟 高速离心机：最大转速为25000转/每分钟 超速离心机：最大转速为25000转/每分钟 以上。
4.超滤分离法
原理：超滤分离法是以压力为推动 力的膜分离法的一种，原理是根据被分 离物质的分子颗粒大小，选择孔径不同 的半透膜。使一定大小的分子透过，而 阻碍另一种物质或分子量较大的物质透 过。此法的实质是各种物质的分子大小 不同，能通过的半透膜的孔径也就不同， 从而能够分离。
蛋白质的存在
广泛存在于生物体内：肌肉、皮肤、发、毛、蹄、角
——主要成分都是蛋白质
植物种子、酶、激素、血红蛋白、细菌、病毒、抗体
——都含蛋白质
蛋白质是组成细胞的基础物质构成人体的物质基础
（一）分离纯化蛋白质的主要原理是：
1.根据分子形状和大小不同进行分离： 如离心、超滤 2.根据分子电离性质（即带电性）的 差异进行分离：如离子交换法、等电 点沉淀法（即酸沉、碱沉）
抗生素等生物制品中的纯化技术
抗生素等生物制品中的纯化技术随着现代医学技术的不断发展，生物制品如抗生素等的应用越来越广泛。
而这些生物制品中的纯化技术也变得越来越重要。
本文就来探讨一下抗生素等生物制品中的纯化技术。
一、纯化技术对生物制品的重要性纯化技术是生物制品制备过程中最基本的技术之一。
它可以减少生物制品中的杂质，提高生物制品的纯度和活性，从而提高生物制品的效果和安全性。
因此，纯化技术对生物制品的生产和应用具有非常重要的意义。
二、纯化技术的种类纯化技术主要包括三种：层析技术、电泳技术和逆流制备技术。
1.层析技术：层析技术是利用分子在固定相和移动相之间的分配系数差异进行纯化的一种技术。
层析技术包括吸附层析、醇沉淀层析、离子交换层析、氢氧化铝层析、凝胶滤过层析等。
2.电泳技术：电泳技术是利用分子在电场中的电性质进行纯化的一种技术。
电泳技术包括凝胶电泳、等电点聚焦电泳、二维凝胶电泳等。
3.逆流制备技术：逆流制备技术是利用逆水流将杂质带走，从而达到纯化的一种技术。
逆流制备技术包括逆流超滤、逆流凝胶过滤、逆流离子交换等。
三、抗生素等生物制品的纯化技术抗生素等生物制品的纯化技术主要采用层析技术和电泳技术。
1. 抗生素的层析技术抗生素的层析技术主要包括吸附层析和离子交换层析两种。
吸附层析是利用抗生素与特定吸附剂的亲和力进行分离的一种层析技术。
离子交换层析是利用离子交换材料对抗生素中离子进行吸附分离的一种层析技术。
2. 抗生素的电泳技术抗生素的电泳技术主要包括凝胶电泳和等电点聚焦电泳两种。
凝胶电泳是利用凝胶的筛选作用进行分离的一种电泳技术。
等电点聚焦电泳是利用抗生素在不同条件下具有不同等电点的特性进行分离的一种电泳技术。
四、结语随着生物制品的应用范围越来越广泛，生物制品的纯化技术也变得越来越重要。
抗生素等生物制品的纯化技术既有层析技术的高效快捷，又有电泳技术的高分辨率，可以满足不同生物制品的不同需求。
未来，生物制品纯化技术的发展将不断推进，为临床治疗提供更加精准、高效、安全的生物制品。
生物工程下游分离与纯化
本课程解决的问题-下游技术
生物分离的一般过程
发酵液/天 然动/植物
预处理
粉碎/加热 溶解/调pH 絮凝或凝聚 再凝聚等
胞外产物
固液分离
沉降 过滤 离心
细胞破碎
均质 超声 研磨 溶胞
细胞碎 片分离
离心分离 萃取 过滤
初步纯化
沉淀 吸附 萃取 膜过滤
高度纯化
吸附色谱 分配色谱 离子交换 凝胶色谱 亲和色谱 液相色谱
生物工程下游分离过程的特点
• ↗满足维持生物物质活性的要求 • ↗满足快速分离的要求 • ↗满足纯度和杂质去除的要求 • ↗满足高效分离的要求 • ↗满足成本优化的要求
生物分离的经济性
• (1) 生物分离至少占总成本50% • (2) 降低废物排放（有时甚至产品：废物=1:3250) • (3) 工艺改造
80%乙腈 洗脱
紫
大孔吸附树脂 杉
脱色提取
醇 粗
提
物
8-12h
或纳滤浓缩
收 集
45℃减压蒸发
有
机
物
严谨而复杂的分离纯化过程！
实例二 血液透析
是急慢性肾功能衰竭患者肾脏替代治疗方式之一。它通过将体内血液引流 至体外，经一个由无数根空心纤维组成的透析器中，血液与含机体浓度相似的 电解质溶液（透析液）在一根根空心纤维内外，通过弥散/对流进行物质交换 ，清除体内的代谢废物、维持电解质和酸碱平衡；同时清除体内过多的水分， 并将经过净化的血液回输的整个过程称为血液透析。
严谨而复杂的清除代谢废物过程！
从以上两个实例：从复杂的体系中分离纯化出目的 产物或者分离清除出代谢废物的过程至关重要！
生物技术专业还开设一门课称为《生物过程下游工艺》
分离纯化微生物的方法
分离纯化微生物的方法
1. 筛选法：将微生物样品接种在富含特定营养物质的培养基上，然后通过表面接种、刺激接种、均质接种等方式，筛选出特定的微生物。
2. 常规分离法：将微生物样品依次接种在不同类型、不同营养成分的培养基上，根据微生物的生长情况，逐步筛选出不同种类的微生物。
3. 滤膜分离法：通过滤膜的孔径大小，将微生物按大小分离，即可以将大体积微生物和小体积微生物进行分离和分析。
4. 游离单细胞分离法：通过显微镜下观察，使用微处理技术，将单个微生物细胞分离出来，独立培养。
5. 分子生物学方法：利用PCR技术，通过多聚酶链式反应扩增出感兴趣的微生物基因片段，并对其进行分离纯化和分析。
大孔树脂分离纯化法
大孔树脂分离纯化法1 大孔树脂分离纯化法的概述大孔树脂分离纯化法是一种常用的生物制品纯化方法，通常用于分离纯化较大的分子，如蛋白质的亚单位。
大孔树脂是指孔隙直径较大的树脂，具有较高的吸附能力和高速流动的性能。
它们的优点在于可以降低蛋白质在溶液中的浓度，通过淡化，从而使蛋白质更容易被分离纯化。
2 大孔树脂的种类大孔树脂分为两类：亲水性大孔树脂和疏水性大孔树脂。
分选的大孔树脂使用亲水性或疏水性，以达到分离纯化蛋白质的目的。
亲水性大孔树脂的凝胶通常由不同程度的交联聚乙烯醇或甲基纤维素制成。
3 大孔树脂的原理大孔树脂分离纯化的原理是分子分离剂析出的原理。
进入大孔中的分子的体积把凝胶分子打开，那么分子就不可能穿过凝胶分子的孔隙，它仅可以附着在孔壁上相应的树脂颗粒越大，其吸附位置越靠近液面上减小，从而减小了溶液中蛋白质的浓度。
通过这种方式，蛋白质就可以被准确地分离出来，并得到纯化。
4 大孔树脂分离技术的应用和限制大孔树脂分离技术具有许多应用程序，例如血液制品的分离，酶和蛋白质的纯化，病毒素的制备等。
然而，该技术也有一些局限性，分子分离种类必须是与凝胶相兼容的。
大孔树脂可能对分子的生理活性造成影响，因此应该在小规模试验中确定其可接受的影响。
不能直接使用悬浮负载大孔树脂进行层析，因为这会影响凝胶颗粒的物理状态和生理活性。
5 大孔树脂层析的步骤大孔树脂纯化的标准程序是由几个步骤组成的，每个步骤都要严格控制。
5.1 前处理和加载原料在介质中使用已准备好的样品，真正的前处理是通过对样品进行离心来去除大颗粒物，过滤残留物等。
5.2 细胞破碎和淀粉样品的制备涉及到高浓度样品的制备，通常在样品中加入盐并界定pH，然后通过超声处理或疏液机进行细胞压碎。
5.3 层析操作将大孔树脂充满柱子，在其上通过加载样品进行净化。
5.4 层析后的处理在层析完成后，确定分离的分母，并分离需要的组分。
6 大孔树脂分离纯化法的未来发展大孔树脂分离纯化法目前已成为生物制剂纯化的一种基础方法，其纯化效果和稳定性已得到广泛认可。
蛋白质分离纯化方法汇总(简洁版)思维导图
02分离纯化 1.流程
1.前处理 1.目的溶液溶解状态释放酶
2.方法 1.细胞破碎 1.微生物（细菌）超声振荡
石英砂研磨
溶菌酶处理
2.动物
电动捣碎机
超声处理3.植物石英砂研磨
纤维素酶
2.提取
加缓冲液，过滤或离心除去细胞碎片及不溶物2.粗分级分离 1.目的分离所需蛋白和其他杂蛋白
2.方法 1.易沉淀盐析
等电点沉淀
有机溶剂分级分离
2.不易沉淀超过率凝胶过滤
冷冻真空干燥
3.细分级分离
1.目的制品纯化，除去大部分杂蛋白
2.方法 1.柱层析凝胶过滤层析
离子交换层析
吸附层析
亲和层析
2.电泳
凝胶电泳
等电聚焦4.结晶只有某种蛋白质在溶液中占有绝对数量优势，才能形成结晶
结晶本身也伴随一定程度的纯化，纯度越高，越容易结晶
2.分类（按纯化依据） 1.分子量 1.测定透析法
超离心法
沉降平衡法
沉降速度法
凝胶过滤法
SDS-PAGE
质谱法
2.纯化凝胶过滤（分子筛层析）
SDS-PAGE
超过滤
2.电荷电泳纸电泳
聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）
毛细管电泳
等电聚焦（IEF）
双向电泳第一向：IEF
第二向：SSDS-PAGE
离子交换层析
3.溶解度盐析
等电点沉淀
有机溶剂分级分离
4.亲和力亲和层析
5.极性逆流分配
纸层析
薄层层析
聚丙烯酰胺薄膜层析
3.纯度鉴定 1.电泳分析IEF
PAGE
SDS-PAGE
2.超速离心
3.HPLC（高效液相色谱）。
第02章 生物制品制备的一般步骤
方法：离心、膜过滤、自然沉降。
目的：将细胞碎片或未充分破碎的组织等杂质去掉。 （三）目的产物的分离纯化 除去可溶性杂质，同时富集目的产物的过程，称之为分
离纯化。这是生物制品制备的核心。
方法：沉淀技术、离心技术、过（超）滤技术、层析技术、 萃取技术、电泳技术等，是生物制品制备的常用技术。 但应注意，生物分子千差万别，不同的目的产物，由于其 物理、化学性质不同，生物学特性迥异，因此没有一个方法适 合于任何生物制品的分离纯化
SDS-PAGE测定蛋白质分子量
凝胶过滤法： 又称分子筛层析法
分子筛层析示意图
蛋白质洗脱体积与分子量的关系
将几种已知分子量的蛋白质混合溶液上柱洗脱，记录各种蛋白质的洗脱 体积。以分子量的对数为纵坐标，以洗脱体积为横坐标，作标准曲线。 待测蛋白质溶液在上述相同的层析条件下分离，记录其洗脱体积，然后 根据标准曲线计算其分子量。
四、蛋白质提取、纯化的一般步骤
1.选材： 制备生物大分子，首先要选择适当的生物材料。 原则：原材料来源充足；目标蛋白含量丰富；易于处理 和提取。 2.生物材料的破碎和预处理：常用的方法有组织匀浆法、
研磨、反复冻融、溶菌酶、高压破碎等。
目的：将目标蛋白以可溶态充分暴露出来，并与其他成 分分离。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
3.粗分离：将绝大多数杂质去掉的过程。方法多为离心、
离子强度等各种参数对溶液中各种组成的综合影响，很难准确
估计和判断，因而实验结果常有很大的经验成份，实验重复性 较差，个人的实验技术水平和经验对实验结果有较大的影响。
三、蛋白质提取、纯化前的准备
在进行蛋白质的制备前，通常需要对以下几方面的内容加
以确定或预先了解。 ①明确实验目的和要求。科研、开发，还是要发现新的物 质。 ②通过文献调研和预备性实验，掌握目的蛋白质的理化性 质和生物学特性。如分子大小；溶解度；电荷；吸附性质；热 稳定性；对配体分子的生物学亲和力等。 ③建立相应的可靠的分析测定方法，这是制备蛋白质的关 键。 ④确定可能的技术路线和实验方案，这是最困难的过程， 要求具有很高的综合知识和实验技术水平。
生物制药中的分离纯化技术
生物制药中的分离纯化技术生物制药是一种通过生物学过程生产的药物，利用微生物、植物和动物等生物系统生产出的生物制剂，在临床治疗中具有极高的价值。
但是，由于不同来源的生物制剂中含有大量的复杂成分，如蛋白质、核酸、多糖等，在生产的过程中需要通过分离纯化技术来提取所需的成分，从而达到纯化和提纯的目的。
一、生物制药的分离纯化技术概述生物制药的分离纯化技术是指通过化学、物理等方法对发酵产生的混合物进行处理，将所需的成分分离和纯化。
分离纯化技术主要包括：1. 溶液层析技术溶液层析是一种通过分子结构、大小、电荷等特性，通过静态或动态的方式，利用吸附剂将混合物中的不同化合物分离开的技术。
溶液层析广泛应用于蛋白质、核酸等大分子生物制品的分离和纯化中。
2. 凝胶过滤技术凝胶过滤是一种利用孔径大小分离分子的技术。
通过将混合物在凝胶柱中进行过滤，大分子会被阻挡在凝胶柱表面，而小分子则可以通过凝胶柱被洗脱。
凝胶过滤主要应用于分离纯化大分子的蛋白质、多肽和核酸等。
3. 离子交换层析技术离子交换层析是一种利用有机或无机离子交换体作为固定相，通过可控制的盐度梯度和pH值来分离混合物的不同成分的技术。
离子交换层析广泛应用于蛋白质、核酸等带电性物质的分离和纯化中。
4. 亲合层析技术亲合层析是一种通过将特定物质负载在固定相上，与混合物中的目标分子发生特异性结合，分离纯化目标分子的技术。
亲合层析一般应用于蛋白质、核酸等生物大分子结构的分离和纯化中。
以上四种分离纯化技术，在生物制药的分离纯化过程中经常使用。
不同的技术适用于不同的生物制品，生产过程会考虑到最终产品的纯度、产量以及经济成本等方面。
二、现代生物制药分离纯化技术的进展当前，随着现代生物技术的发展，生物制药的分离纯化技术也得到了不断的进步和完善。
新的技术和方法不断涌现，不仅可以提高生产效率，而且还可以提高产品的纯度和质量，降低产品的成本。
以下是一些新技术的介绍。
1. 前体蛋白纳米管系统前体蛋白纳米管系统是利用基因工程技术，将生物分子直接吸附在纳米管表面，从而实现分离的目的。
高中常见生物样品的分离与提纯
高中常见生物样品的分离与提纯细胞分离与提纯
血液细胞的分离
1.以血液为样品，先使用胶体渗析或沉淀方法去除红细胞。
2.剩余的白细胞可以通过离心法获得，离心将白细胞与血浆分离。
3.离心后的白细胞可以通过溶解红细胞膜、洗涤和离心等步骤进一步纯化。
细菌的分离
1.取得细菌培养物，可以通过离心法将细菌与培养基分离。
2.经过离心后，可以通过定量稀释的方法将细菌浓度降低。
3.将稀释后的细菌涂布在琼脂平板上进行单菌落分离。
DNA提取与纯化
1.先将细胞裂解，破坏细胞膜和核膜，释放DNA。
2.加入蛋白酶等酶类去除蛋白质。
3.通过酒精沉淀法将DNA从混合物中分离出来。
4.使用乙醇和洗涤缓冲液等方法进行DNA的纯化。
蛋白质提取与纯化
1.先将细胞破坏，释放细胞内蛋白质。
2.使用溶液进行离心，去除细胞残渣。
3.使用離子交換層析、凝膠层析或亲和层析等技术对蛋白质进行提纯。
以上是高中常见生物样品的分离与提纯方法。
对于每种样品，根据具体实验和目的，还可以根据需要使用其他特定的方法进行进一步的纯化和分离。
实验过程中应注意正确操作、安全使用实验器材，并根据老师或指导书的要求进行实验设计和数据记录。
简述一般生物制品分离纯化的流程
简述一般生物制品分离纯化的流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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生物药物的提取纯化技术
按照膜的结构分为对称性膜、不对称膜和复合 膜。
用于生物制药工业中的膜材料要求耐温性能 要好、耐酸碱处理、有较好的生物相容性（即要 求膜对蛋白质和酶等生物大分子不产生变性，无 抗原性）。
按照膜的材料可分为合成聚合物膜、 无机材料膜和不锈钢膜。如常用的微滤膜 材料有醋酸纤维酯和硝酸纤维酯、再生纤 维素和聚四氟乙烯等，超滤膜材料有聚砜、 聚醚砜、聚偏二氟乙烯、硝酸纤维酯(或 醋酸纤维酯)、尼龙、丙烯腈-氯乙烯共聚 物膜。此外还有不锈钢膜。
以上各个部分都要有验证材料或试验数据，根 据这些材料和数据写出验证报告。当工艺的某一 部分有较大变动 (大修、工艺条件变化)时，要进 行重新验证（再验证）。再验证是针对某一部分 的行动，而不是整个工艺过程的验证，因此比较 简单、快速、易行。验证的实施过程包括以下步 骤：提出验证要求、组织验证小组、制定验证方 案、实施验证试验、写出验证报告和再验证。
五、生物药物生产的屏蔽防护技术 (Containment technology)
一些药物(如抗癌药)往往对生物活细胞具有毒 性，因此必须对中试或大生产的全过程设置屏蔽 防护装置。其基本要求是：人员进出口要加以控 制；在工作场所保持负压(一级、二级或三级生物 密封室)；空气的排放必须通过HEPA过滤器；对 有烟雾产生的设备要有附加的屏蔽防护装置；有 适当的个人防护措施；生产过程中所排放的废物 要有生物学或化学的除污方法；对工作人员进的单元操作和基本工艺流程
生物药物的提取和纯化可分为5个主要步 骤：预处理、固液分离、浓缩、纯化和产 品定型(干燥，制丸，挤压，造粒，制片)。 每一步骤都可采用各种单元操作。在提取 纯化过程中，要尽可能减少操作步骤，因 为每一操作步骤都不可避免带来损失。生 物药物提取工艺流程的基本模式如图7-1所 示。
生物产品分离纯化的一般工艺流程及发展前景
⽣物产品分离纯化的⼀般⼯艺流程及发展前景⽣物产品分离纯化的⼀般⼯艺流程1.⽣物材料的来源及选择⽣物产品的种类繁多，如氨基酸及其衍⽣物、蛋⽩质、酶、核酸、多糖、脂类等。
各种⽣物物质主要来源于它们⼴泛存在的⽣物资源中，包括天然的⽣物体及其器官、组织以及利⽤现代⽣物技术改造的⽣物体等，归纳起来主要有以下⼏种:①植物器官及组织植物器官及组织中含有很多活性成分，我国药⽤植物种类繁多，从天然植物材料中寻找和提取有效⽣物药物已逐渐引起⽖视，品种逐年增加。
此外，转基因植物可产⽣⼤览的以传统⽅式难以获得的⽣物物质。
②动物器官及组织以动物器官和组织为原料可制备多种⽣物制品，从海洋⽣物的器官和组织中获取⽣物活性物质是⽬前研究的热点和重要的发展趋势。
③⾎液、分泌物及其他代谢物⼈和动物的⾎液、尿液、乳汁，以及胆汁、蛇毒等其他分泌物与代谢产物也是⽣物物质的正要来源。
④微⽣物及其代谢产物微⽣物种类繁多，其代谢产物有1300多种，应⽤前景⼴泛。
以微⽣物为资源，除了可⽣产初级代谢产物如奴荃酸、维⽣索外，还可⽣产许多次级代谢产物如抗⽣素等。
⑤动植物细胞培养产物细胞培养技术的发展使得从动物细胞、植物细胞中获得有较⾼应⽤价值的⽣物物质成为可能，且发展迅速，前景⼴阔。
选择⽣物材料主要根据实验的⽬的⽽定。
从⼯业⽣产⾓度来考虑，⾸先是材料来源丰富、含量⾼、成本低。
有时材料来源丰富但含最不⾼，或者材料来源、含量都很理想，但材料中杂质太多，分离纯化⼿续⼗分烦琐，以致影响质量和收率，反不如含量低些但易于操作获得纯品者。
因此，必须根据共体情况，抓住主要⽭后⽽决定取舍.如果为了科学实验和某种特殊需要，例如从某种材料或某⼀⽣物品种中寻找某种未知物质，选材时则⽆需全⾯考虑上述问题，只要能达到实验⽬的即可。
2.分离纯化的⼀般⼯艺流程由于⼯业⽣物技术产品众多，原料⼴泛，性质多样，⽤途各异，且对产品质量与纯度的要求也可以是多⽅⾯的，因⽽其分离纯化技术、⽣产⼯艺及相关装备也是多种多样的。
生物分离与纯化
影响Rf的因素，和功能基极性有关，小分子化合物比大分子化合物机极性大，和某些细微结构有关（H键，异构体）
吸附色谱法的基本操作，装柱，湿法装柱；将吸附剂加入和适量的色谱最初用洗脱剂调成稀糊状，先把放好棉花，沙子的色谱柱下口打开，然后将制好的糊浆灌入柱子。操作要慢不要将气泡压入吸附剂。一定要保持吸附剂上有溶剂，切勿流干。最后让吸附剂自然下沉。当洗脱剂刚好覆盖吸附剂平面式，管紧下口活塞
去除镁离子可用草酸
去除铁离子可用黄血盐
包括原料的选取和预处理，分离提取，精制和成品制作。
预处理的目的改变发酵液的性质和去除发酵液中得部分杂质。
利用多孔介质截留固-液悬浮液中得固体粒子，进行固液分离的方法称为过滤。过滤可分为常规过滤和错流过滤。滤液的阻力来自于过滤介质和滤饼。常用的惰性过滤剂有硅藻土，珍珠岩，纤维素和活性炭。
色谱分离是利用多组分混合物中物理化学性质的差别使各组分以不同程度分布在两个相中。
如何选择离子交换树脂？
1）根据目的物选择离子交换树脂，当被分离物质带正电荷采用阳离子交换树脂；被分离物质带负电荷，采用阴离子交换树脂，当目的物具有较强的碱性和酸性时，选用弱酸性或弱碱性的树脂；根据分离目的进行选择H型或者OH型；2）根据操作条件选择，交换时的PH，溶液中产物的浓度，洗脱条件。3）按照离子交换树脂的处理，转型，再生和保存进行选择。
一些天然的或合成的水溶性聚合物水溶液，当它们与第二种水溶液聚合物相混时，只要聚合物浓度高于一定值就可能产生香的分离，形成双水相体系。
双水相萃取技术的工艺流程，目的产物的萃取，PEG的循环，无机盐的循环。-
影响因素，聚合物及其相对分子质量，PH，温度，离子环境对蛋白质在亮相体系分配
超临界流体萃取；在较高的压力下，将溶质溶解于流体中，然后降低流体溶液的压力或升高流体溶液的温度，使溶解于超临界流体中的溶质因其密度下降，溶解度降低而析出，从而实现特定溶质的萃取。
微生物制品的常规提纯方法及原理
微生物制品的常规提纯方法及原理微生物制品是指通过微生物培养和发酵得到的一系列产品，如抗生素、酶、维生素、有机酸、氨基酸等。
这些微生物制品常常需要进行提纯，以去除杂质、纯化目标产物，提高产品纯度和活性。
下面将介绍微生物制品常用的几种提纯方法及其原理。
1.离心法离心法是一种常用的提纯方法，通过离心机的作用，利用目标产物与其他组分在离心力的作用下具有不同的沉降速度来分离。
它适用于分离微生物培养液中的胞体、细胞碎片等大颗粒物质。
离心法的原理是根据离心力的大小，使悬浮物质沉降到离心管底部，然后将上清液取出。
2.沉淀法沉淀法利用目标产物和其他组分在溶液中的溶解度差异来分离纯化。
常用的沉淀剂包括酒石酸、硫酸铵、硝酸铵等。
沉淀法原理是通过加入适量的沉淀剂，使部分产物沉淀，然后通过离心等方法分离出沉淀物。
这种方法适用于微生物培养液中目标产物具有较高的溶解度，而其他杂质物质的溶解度较低的情况。
3.电泳法电泳法是一种利用目标产物在电场中的运动迁移差异进行分离的方法。
电泳法常用于蛋白质等分子的分离和纯化。
电泳法原理是在电场作用下，目标产物带有电荷，在电场中发生迁移，而其他组分则迁移到不同位置，从而实现分离。
电泳有凝胶电泳和毛细管电泳两种常见形式。
4.透析法透析法是一种利用溶剂的渗透作用，通过半透膜分离目标产物和杂质的方法。
透析法根据目标产物和杂质分子大小及透析膜的性质选择适当的透析膜和透析液，使目标产物可以通过透析膜，而较大的杂质分子和小分子溶质则被滞留在透析膜内。
透析法适用于目标产物相对较大，溶质与透析膜有一定选择性的情况。
5.超滤法超滤法是一种利用超滤膜的特殊孔径分离目标产物和杂质的方法。
超滤法原理是利用超滤膜的孔径大小选择，目标产物和较小分子溶质可以通过膜孔径，而较大的杂质分子则滞留在膜上。
超滤法适用于目标产物相对较大，而杂质分子相对较小的情况。
6.柱层析法柱层析法是一种利用各种吸附树脂、凝胶等材料对目标产物和杂质物质的不同亲和力进行分离的方法。
生物制药工艺中的分离纯化技术
生物制药工艺中的分离纯化技术Introduction生物制药工艺包括发酵、提取、分离纯化等多个环节。
其中，分离纯化技术是制备高纯度的生物制品的重要步骤。
该技术通过分离并清除混杂的非目标成分，从而提高产品纯度和产量。
本文将重点介绍生物制药工艺中的分离纯化技术。
Chromatography层析法是目前最常用的分离纯化技术之一。
层析法通过固定在固定相上的分离剂与流动相中的目标分子发生选择性相互作用，实现目标分子的纯化。
常见的层析方法有凝胶层析、离子交换层析、亲和层析、逆相层析等。
凝胶层析是利用固相微粒与样品中的分子发生分子筛效应和凝胶效应的一种分离手段。
其具有高分离效果、易实现规模化等特点。
但同时，由于凝胶层析对样品的流动性要求较高，且需要长时间的渗透层析过程，因此操作较为繁琐，实时监控难度较大。
离子交换层析是分离离子性分子的有效方法。
在离子交换层析中，液相固相都是带电的。
如果样品分子带有与固相上载体不同的电荷，则在通过固相之前会和溶液中的离子交换，从而吸附在固相上。
亲和层析依靠目标分子与分离剂之间的生物特异性相互作用，主要应用于分离高分子生物分子，如蛋白质、DNA等生物大分子。
亲和层析可分为尖端亲和层析和逆尖端亲和层析。
逆相层析的移动相为极性较大的有机溶剂，被固定相吸附的物质则具有较强的疏水性。
逆相层析广泛用于天然产物物质的纯化，包括蛋白质、生物碱及药物衍生物等。
Electrophoresis电泳是在外加电场的作用下，将电荷带有不同的生物分子分离开的技术。
电泳是广泛用于分离核酸、蛋白质和多肽等生物分子的方法。
在电泳中，由于受电荷、尺寸、形态等影响的分子速度不同，因而发生空间分离。
电泳方法包括蛋白质电泳和核酸电泳等。
Size Exclusion Chromatography分子筛层析是一种可以分离物体内不同分子大小的技术。
分子筛色谱的基本原理是将包含有混合物的样品溶液通过一列固定相，并使不同分子进入固定相中，以分离出不同的组分。
生物制品的纯化及其结构分析
生物制品的纯化及其结构分析随着人们对生物活性物质的深入研究和应用，纯化技术在生物制品的生产过程中显得尤为重要。
纯化的目的主要是为了提高产品的纯度和稳定性，并降低不必要的副作用。
通常情况下，纯化的方法取决于生物制品的化学性质和生产规模。
在生产过程中，生物制品的纯化涉及到许多技术，在此我们将重点讨论离心分离和色谱技术，并介绍生物制品的结构分析方法。
离心分离技术离心分离是生物制品纯化过程中最常用的一种技术，其原理基于生物分子在不同离心力下的沉降速率不同。
最常用的离心分离方法有两种：差速离心和密度离心。
差速离心利用了一组离心管，加上不同速度的离心力。
样品混和在一起后，应当能以不同的沉降率分离开来。
这个沉降率由分子的体积来确定，也由溶液的密度特性所限制（如黏性）。
通过差速离心可以分离分子之间体积差异大的分子，如蛋白质。
另外一种使用较为广泛的离心分离方法是密度梯度离心。
密度梯度离心是利用离心离心管的同轴放置来构造密度梯度。
将样品置于密度大的解决方案的上部，是能够随着高速旋转而沉入密度较低梯度的位置。
在此过程中，生物分子将沉降到密度梯度范围内的位置，并依此进行分离。
密度梯度离心法常用于分离染色体蛋白复合物、膜蛋白和细胞溶胶。
色谱技术色谱技术是另一种重要的生物制品纯化技术，它主要依赖分子的某些特性，如大小、荷电性或生物活性能够进行筛选、分离。
色谱技术常用的有三种：层析色谱、离子交换色谱和亲和色谱。
层析色谱是将混合的分子溶液通过填充固相柱（如树脂）的分离过程。
该过程中，分离基于分子在不同柱材时在固相和溶相之间交互作用的差异。
根据不同色谱模式和液相充填剂，分离体系可以采用逆相层析、大小排除层析或疏水作用等方式，能够对单一的分子进行高度纯化。
离子交换色谱是以固相为离子树脂的柱为主宰。
离子交换多为吸附和解吸，即离子交换柱中的分子通过持续而非破坏性相互作用，最终达到分离之目的。
离子交换柱的交换基团可以为羧基、氨基、磷酸基、硫酸基等具有吸附性的阳离子或阴离子。
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核酸类药物可分为两大类： 一类是具有天然结构的核酸类药 物，这类物质有助于改善机体的 物质代谢和能量平衡，修复受损 伤的组织，所以这类药物已广泛 用于放射病、血小板减少症，白 细胞减少症、急慢性肝炎和肌肉 萎缩等疾病。
另一类核酸类药物为天然核酸的 类似物或衍生物，这类药物具有 干扰肿瘤、干扰病毒代谢的功能， 因此在治疗病毒性疱疹、艾滋病、 肿瘤方面有一定的疗效。
超滤是分离生物活性物质 常用的方法，此外还有透析 法、反渗透法等，都是利用 各种半透膜的选择透过性进 行分离的技术。
超滤装置， 有板式、 管式、卷 式、中空 纤维式等 形式。
中空纤维式
其他常用的分离纯化生化物质的 方法： 5.盐析法 6.亲和层析法 7.吸附法 8.电泳法
二、核酸类制品的分离纯化
原理：多数的生物活性物质都是带电物质， 都有自己的等电点，这些带电基团所带电荷 的数量与PH密切相关。当溶液的PH大于生 物大分子的等电点时，该物质带负电荷；当 溶液的PH小于物质的等电点时，该物质带正 电荷，当溶液的PH等于物质的等电点时，该 物质的净电荷为零，此时的生物大分子溶解 度最低，会聚集到一起形成沉淀而从溶液中 析出。
蛋白质的存在
广泛存在于生物体内：肌肉、皮肤、发、毛、蹄、角
——主要成分都是蛋白质
植物种子、酶、激素、血红蛋白、细菌、病毒、抗体
——都含蛋白质
蛋白质是组成细胞的基础物质构成人体的物质基础
（一）分离纯化蛋白质的主要原理是：
1.根据分子形状和大小不同进行分离： 如离心、超滤 2.根据分子电离性质（即带电性）的 差异进行分离：如离子交换法、等电 点沉淀法（即酸沉、碱沉）
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
第二节 各类生物制品的分离纯化方法
一、蛋白质类制品的分离纯化
概述 蛋白质（protein）是生命的物质基础，没有蛋 白质就没有生命。因此，它是与生命及与各种 形式的生命活动紧密联系在一起的物质。机体 中的每一个细胞和所有重要组成部分都有蛋白 质参与。蛋白质占人体重量的16.3%，即一个6 0kg重的成年人其体内约有蛋白质9.8kg。人体 内蛋白质的种类很多，性质、功能各异，但都 是由20多种氨基酸按不同比例组合而成的，并 在体内不断进行代谢与更新。
有机溶剂的选择：有机溶剂沉淀法常 用的有机溶剂为乙醇，因为乙醇在水 中的溶解度大，毒性小，操作方便。 用乙醇去沉淀生物大分子就是我们常 说的醇沉。 例如应用乙醇分离血浆蛋白，控 制乙醇浓度在8%时得到血纤蛋白原， 乙醇浓度在25%时得到丙种球蛋白， 乙醇浓度在40%时得到α、β球蛋白。
2.等电点沉淀法（酸沉、碱沉）
• 1.提取：
• （1）难溶于水、可溶于稀碱液者：碱 提醇沉。 • （2）易溶于温水、难溶于冷水和乙醇 者：热水提取，离心去除杂蛋白，再 加乙醇沉淀得多糖。
• （3）粘多糖的提取：因大部分多 糖与蛋白质结合，因此需要先酶解 或碱解去蛋白，再用水或盐溶液提 取，用乙醇沉淀得多糖。
• 2.纯化 • 醇沉完的多糖仍有少量的蛋白质， 和小分子杂质，去掉杂质蛋白质的 方法有等电点沉淀法、加热变性法 等；去掉小分子杂质最常用的方法 是透析和超滤法，特别是超滤适合 于大规模生产。
方法：溶液的PH达到目的物的等 电点时，目的物就会沉淀分离，所 以向含有生物活性成分的溶液中加 入酸或碱，来调节溶液的PH，使 溶液的酸碱度达到工艺要求，就能 使目的物沉淀而分离出来。这就是 平时常说的酸沉与碱沉。
3.离心分离法
在固相和液相混合体系中，要把两相分离开 来，通常有两种方法，一种是过滤，一种是 离心。离心是分离技术中最常用的方法之一， 它对于固体颗粒小，溶液粘度大的溶液以及 细胞培养液或生物材料的大分子抽提液是十 分有效的，尤其是对于用一般过滤难以奏效 的物质，采用离心技术可达到分离的目的。 尤其是高速和超速冷冻离心机的相继问世， 离心已成为生化、生物工程、生物制药的分 离纯化的重要方法。
• 核酸是重要的生物大分子化合物，所有的 有机体中都含有核酸。核酸占有机体细胞 干重的5％～15％。 • 核酸是生物体遗传和变异的物质基础。 对遗传物质DNA、RNA的研究，尤其是利 用DNA重组技术进行的基因工程的研究一 直是生物工程中的热点和重点问题。
概 述
核酸是由核苷酸组成的具有复杂 三维空间结构的大分子化合物， 是遗传的物质基础。 核酸分为两类，一类是脱氧核糖 核酸（DNA），主要存在于细胞 核的染色质中，另一类是核糖核 酸（RNA）主要存在于细胞质中。 RNA按结构和功能不同又可分为 三类：核糖体RNA，信使RNA和 转运RNA。
离心机类型
普通离心机：转速不超过6000转/每分钟 高速离心机：最大转速为25000转/每分钟 超速离心机：最大转速为25000转/每分钟 以上。
4.超滤分离法
原理：超滤分离法是以压力为推动 力的膜分离法的一种，原理是根据被分 离物质的分子颗粒大小，选择孔径不同 的半透膜。使一定大小的分子透过，而 阻碍另一种物质或分子量较大的物质透 过。此法的实质是各种物质的分子大小 不同，能通过的半透膜的孔径也就不同， 从而能够分离。
3.根据分子极性大小及溶解度不同 进行分离：如有机溶剂分级沉淀 法（即醇沉）、盐析法。 4.根据物质吸附性质的不同进行分 离：如吸附层析法。 5.根据配体特异性进行分离：如亲 和层析。
（二）分离纯化常用方法
1.有机溶剂沉淀法（醇沉）：
原理：在溶液中，生物大分子自身所带的电 荷能与水相互作用，在大分子表面形成水化 膜，保证了生物活性物质的稳定性。但在水 溶液中加入有机溶剂（如乙醇）后，有机溶 剂会破坏大分子表面的水化膜，另外，加入 有机溶剂会使溶液的极性减小，生物大分子 在溶液中的溶解度就会降低，从而产生沉淀， 这样目的物就从水溶液中沉淀而分离了出来。
3.RNA药物的用途： 用于精神迟缓、记忆衰退。
2.DNA的提取与分离
（1）材料的选择：制备DNA的材 料一般用小牛胸腺或鱼精，这类组 织的细胞体积较小，如鱼精，整个 细胞几乎全部被细胞核所占据，细 胞质的含量极少故这类组织的 DNA含量较高。
（2）提取
将含有DNA的沉淀物用0.14mol/L的氯 化钠溶液反复洗涤，尽量除去RNA， 然后用生理盐水溶解沉淀物，并加入到 去污剂SDS溶液中使DNA与蛋白质解 离、变性。冷藏过夜，再加入氯化钠使 DNA溶解，过滤取上清液，加入乙醇 使DNA析出，反复几次可得到高纯度 DNA.
原理：离心分离时的样品物质通常是 悬浮在某一特定的液相介质中，由此 而形成的固液悬浮体系，将该体系放 入离心机的离心管内，开机后样品物 质做匀速圆周运动，于是就产生了一 个外向离心力。而由于不同颗粒的质 量、密度、大小不同，在同一液相介 质和相同的离心力场下，沉降速度各 不相同，颗粒由大到小沉淀，这样就 会产生分层，从而达到彼此分离。
3.DNA药物的用途： 有抗放射作用。
三、糖类药物的分离纯化
糖的分类：
单糖
葡萄糖、果
糖
按分子组 成可分为
双糖
乳糖、蔗糖、 麦芽糖
多糖
淀粉、纤维素、 糖原
（一）单糖及其衍生物的制备
1.提取：单糖易溶于冷水 和温乙醇中，可用水及 50%乙醇提取， 2.提纯：用醋酸铅盐析除 去蛋白质杂质。
（二）多糖的分离与纯化
1.RNA的提取与分离
（1）材料的选择：制备RNA的材 料大多选取动物的肝、肾、脾等核 酸量丰富的组织。工业生产上主要 用啤酒酵母、面包酵母等真菌的菌 体为原料。
（2）提取
A:乙醇沉淀法:将核糖核蛋白溶于碳酸氢钠溶 液中，然后加入少量辛醇的氯仿溶液，并连 续震荡，以沉淀除去蛋白质杂质。去沉淀留 上清液，加入规定量乙醇使RNA沉淀析出即 得。 B:去污剂处理法：在核糖核蛋白溶液中加入 去污剂，使蛋白质沉淀，过滤得上清液，再 加乙醇使RNA沉淀。常用的去污剂有SDS （十二烷基磺酸钠）、氯仿等。
复习：
生物制品：生物制品系指以微生物、寄 生虫、动物毒素、生物组织作为起始材 料，采用生物学工艺或分离纯化技术制 备，并以生物学技术和分析技术控制中 间产物和成品质量制成的生物活性制剂。 包括疫（菌）苗、毒素、类毒素、免疫 血清、血液制品、免疫球胆白、抗原、 变态反应原、细胞因子、激素、酶、发 酵产品、单克隆抗体、DNA重组产品、 体外免疫诊断试剂等，供某些疾病的预 防、治疗和诊断用。