定量PCR引物、探针设计原则
PCR和定量PCR的引物和探针设计
引物和探针设计 –PCR 和定量PCR基本原理引物设计的重要因素针对特殊应用的其他提示引物的质量和纯度目录1247基本原理引物是短的寡核苷酸，充当DNA复制的起始点。
因为几乎所有DNA聚合酶都不能从头合成，所以它们需要一个3'-羟基作为DNA合成的起始点。
这个3'-羟基由相配的引物提供。
引物在体内由RNA聚合酶（称为引物酶）生成。
这些引物（在此为小RNA）由DNA聚合酶用作延长的起始点。
在延长过程中，RNA引物降解并由DNA取代。
体外扩增反应，如聚合酶链反应（PCR）或逆转录（RT），需要引物。
通过选择特异的引物序列，DNA 片段的所需区域可得到扩增。
对于大多数PCR反应，决定整个反应成功与否的最重要因素是引物的序列和质量。
在开始引物设计之前，必须弄清以下几点：PCR的目的（例如定量检测、克隆、基因分型）PCR类型（定量PCR、RT-PCR、长片段PCR)样品材料（基因组DNA、RNA、微小RNA）可能的问题（例如假基因、SNP)1引物设计的重要因素2有一些不同的软件工具可用于引物设计和序列分析。
它们能简化相配引物对的搜索，一般考虑以下标准。
最流行的软件为Primer 3()，它是大多数基于网络引物设计应用的基础。
典型的引物长度为18-30个碱基。
短的引物（15个核苷酸以下）能非常高效地结合---但是它们的专一性不够。
非常长的引物能提高专一性，但是退火效率低，从而导致PCR 产物量低下。
应避免编码单一序列和重复序列的引物。
引物长度和专一性引物的GC 含量应介于40%和60%之间。
应避免聚-（dC ）-或聚（dG ）-区域，因为它们会降低退火反应的专一性。
聚-（dA ）-和聚（dT ）-也应避免，因为这会生成不稳定的引物-模板复合物，从而降低扩增效率。
平衡GC含量，避免GC-和AT-富集区域退火温度是基于引物的解链温度（Tm ）计算。
最常用的解链温度计算公式显示如下。
“2+4”法则，亦称华莱士法则，对于极短的寡核苷酸（最多14个碱基）有效，该法则提出每个AT 对能将双链DNA 的解链温度提高2°C ，每个GC 对则能提高4°C 。
探针的设计原则
实时荧光Taqman 探针设计的几个要点实验室很多同学都要做Real time PCR实验，实验室的师兄师姐都会有很多宝贵意见，不过也有实验室前没有做过的，查找了下资料和大家分享下关于实时荧光Taqman探针设计、实时荧光PCR探针的选择、引物的设计及评价。
荧光探针法是用序列特异的荧光标记探针来检测产物，探针法的出现使得定量PCR技术的特异性比常规PCR技术大大提高。
目前较常提及的有TaqMan探针、FRET杂交探针(荧光共振能量传递探针)和分子信标Molecular Beacon。
广泛使用的TaqMan探针法是指PCR扩增时在加入一对引物的同时另外加入一个特异性的荧光探针，该探针只与模板特异性地结合，其结合位点在两条引物之间。
探针的5′端标记有荧光报告基团(Reporter, R)，如FAM、VIC等，3′端标记有荧光淬灭基团(Quencher, Q)，如TAMRA等。
当探针完整的时候，5′端报告基团经仪器光源激发的荧光正好被近距离的3′端荧光基团淬灭，仪器检测不到5′端报告基团所激发的荧光信号(就是说5’荧光基团的发射波长正好是3’ 荧光基团的吸收波长，因而能量被吸收传递到3’荧光基团而发出其它荧光)。
随着PCR的进行，Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其5′-3′外切酶活性(此活性是双链特异性的，游离的单链探针不受影响)就会将切割探针，释放5′端报告基团游离于反应体系中，远离3′端荧光淬灭基团的屏蔽，5′端报告基团受激发所发射的荧光信号就可以被探头检测到。
也就是说每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。
报告信号的强度就代表了模板DNA的拷贝数。
(请注意，该图显示的不是普通的Taqman探针法，而是Taqman MGB探针法)Taqman探针检测的是积累荧光。
常用的荧光基团有FAM，TET，VIC，HEX等等。
当探针完整的时候，由于3′端的荧光淬灭基团在吸收5′端报告基团所发射的荧光能量，本身会发射波长不同的荧光而导致本底高，因此TaqMan探针近来又有新的发展——TaqMan MGB探针。
引物探针设计原则
引物探针设计原则引物探针是分子生物学和遗传学研究中广泛应用的工具，它们用于检测给定的DNA序列并在其特定的位置与其结合。
引物探针有许多种类型，但设计它们的原则是大致相同的。
本文将介绍引物探针设计的原则。
1. 引物探针应当特异性。
引物探针的最初设计原则是确保其特异性，即只在目标DNA序列上结合，而不在其他DNA序列上结合。
特异性可通过许多方式实现，如控制探针长度或通过选择引物的位置来避免与其他DNA序列的结合。
特异性也是确保引物探针的准确性和可靠性的关键。
引物探针长度对于其正确结合和探测目标DNA序列至关重要。
长引物比短引物更具特异性，因为它们有更多的机会与目标DNA序列结合。
此外，长引物对于特异性的保持和探测的灵敏度也更好。
3. 引物探针的选择应当优先考虑其3'端。
引物探针的3'端是其结合目标DNA序列的关键区域。
由于DNA聚合酶在扩增反应过程中是从3'端往5'端进行合成的，因此引物探针的3'端需要与目标DNA序列上的互补碱基配对。
在引物设计过程中，选择具有良好稳定性的3'端可以提高反应的特异性和酶活性。
4. 引物探针应当遵循PCR特定的设计规则。
在PCR（聚合酶链式反应）中，引物对于扩增反应的成功非常重要。
因此，在设计PCR 反应时需要考虑许多特定的因素。
例如，引物长度和序列，引物间的距离（扩增产物的大小）以及熔解温度等。
PCR反应的成功与否往往取决于如何正确地设计引物。
5. 引物探针应当特异地结合到目标DNA序列上。
良好的引物探针应当具有明确的探针特异性，在其结合目标DNA序列时表现出特异性。
因此，对于特定实验需要，探针的选择需要进行优化。
方法包括，评估引物和探针的特异性，交叉验证引物和探针与基因组的互补性，并对引物进行最佳的化学修饰和结构设计。
结论引物探针对于许多分子生物学研究非常重要。
在设计引物探针时，需要考虑许多因素，如特异性、长度、优先考虑3'端、PCR特定的设计规则和特异地结合目标DNA序列。
定量PCR Taqman探针设计要领-2
定量PCR Taqman探针设计要领-2第三步：寻找一家信赖的公司合成引物和探针，一般引物合成大家比较熟悉，而且价格也比较便宜（特别是这两年便宜了许多），而探针则相对来说贵了许多，一般Taqman探针合成在1000到5000元不等（不同的合成要求价钱不同）——而这只是标记价钱，序列合成基本上和引物合成价钱相似。
第四、五、六步：一般的定量PCR反应体系与普通PCR其实也差不了多少，只是要加入Taqman探针，另外不同就是分步法的不同。
其中需要注意的是：* 扩增酶最好选用热启动酶* 引物和探针的浓度需要进行优化，有人建议从50nM开始，在50nM—900nM之间优化，一般为200nM（注意探针需要避光保存。
* 同样Mg+和酶量也需要进行优化，酶的推荐反应浓度是1.25-1.5U（50ul）* DNA模板的添加量通常在100 ng以下，因不同种类的DNA模板中含有的靶基因的拷贝数不同，必要时可进行梯度稀释，确定最佳的DNA模板添加量。
如果欲进行2 Ste p RT-PCR反应的第二步PCR扩增反应，第一步的RT反应液作为DNA模板时的添加量不要超过PCR反应液总体积的10%。
另外循环参数虽然在引物和探针设计完之后也就确定了，但是有时也需要进行优化。
第七步：在进行数据分析的时候，通常用不同浓度的标准样品的Ct值来产生标准曲线，然后计算相对方程式。
方程式的斜度可以用来检查PCR的效率，对于100%PCR效率来说，一个理想的斜率是3.32。
最佳的标准曲线是建立在PCR的扩增效率为90%-100 %(100%意味着在每个循环之后，模板的总数将增加为前一次的2倍)的基础上。
所有标准曲线的线性回归分析需要存在一个高相关系数(R2≥0.99) ，这样才能认为实验的过程和数据是可信的。
使用这个方程式我们可以计算出未知样本的初始模板量。
大多数定量PCR仪都有这样一个软件，它可以从标准曲线中自动地计算出未知样本的初始模板量。
定量PCR引物探针设计原则
定量PCR引物探针设计原则定量PCR（Quantitative Polymerase Chain Reaction）是一种用于测量DNA分子数量的技术。
在进行定量PCR实验时，合理设计引物和探针非常重要，下面将探讨一些定量PCR引物和探针设计的原则。
1.引物设计原则：1.1引物长度：引物的长度一般在18-30个碱基对之间，过短的引物可能导致非特异性扩增，而过长的引物可能导致扩增效率降低。
1.2引物的GC含量：引物的GC含量应在40-60%之间，过高或过低的GC含量都可能导致非特异性扩增。
1.3引物的熔解温度（Tm）：引物的熔解温度应在50-60摄氏度之间，可以通过计算引物序列的碱基组成和长度来预测引物的Tm值。
1.4引物的特异性：引物的特异性是设计引物时最关键的考虑因素之一、引物的特异性可以通过检查与该引物匹配的靶标序列在基因组或转录组中的唯一性来评估。
可以使用生物信息学工具，如BLAST（基本局部序列比对）来分析引物的特异性。
此外，还可以使用引物的3'末端碱基序列的特异性来提高引物的特异性。
2.探针设计原则：2.1探针的长度：探针的长度一般在20-30个碱基对之间。
2.2探针的熔解温度（Tm）：与引物类似，探针的Tm值也应在50-60摄氏度之间。
2.3探针的特异性：与引物一样，探针的特异性也是设计探针时需要考虑的重要因素。
探针的特异性可以通过生物信息学工具来分析，如BLAST。
此外，还可以设计探针的3'末端碱基序列来提高其特异性。
2.4探针的化学修饰：在实验中，通常使用荧光标记的探针来实现定量PCR。
探针可以通过荧光基团，如FAM、VIC、HEX等进行标记。
此外，还可以在探针的两端引入磷酸酯键或磷酸二酯键等化学修饰，以提高探针的稳定性和特异性。
总结起来，定量PCR引物和探针的设计需要考虑引物长度、GC含量、熔解温度和特异性等因素。
在设计引物和探针时，可以使用生物信息学工具来分析其特异性，并通过化学修饰来提高其稳定性和特异性。
多重荧光定量pcr引物和探针设计方法
多重荧光定量pcr引物和探针设计方法多重荧光定量PCR（Multiplex qPCR）是一种利用多组引物和探针同时扩增和检测多个靶标序列的技术。
它具有高通量、高灵敏度、高特异性和高精确性的优点，广泛应用于基因表达定量、基因突变检测、病毒感染检测等领域。
为了设计适用于多重荧光定量PCR的引物和探针，需要考虑以下几个方面。
1. 靶标选择与设计首先，需要选择适合于多重荧光定量PCR的靶标序列。
靶标序列应具有明显的差异性，能够有效区分不同的样本。
此外，还应该考虑靶标序列的长度，推荐长度在100-200bp之间。
最好通过生物信息学工具进行靶标序列的选择和设计。
2. 引物设计在多重荧光定量PCR中，每个靶标序列需要设计一对引物。
引物的设计应遵循以下原则：（1）引物长度：引物长度一般在18-24个碱基之间，尽量保持相似的长度。
（2）引物Tm值：引物的熔解温度（Tm）应相似，通常应在55-65℃之间。
（3）引物特异性：引物应具有较高的特异性，避免与非靶标序列发生非特异性扩增。
（4）引物相互作用：不同引物之间应避免相互作用，特别是避免引物间的二聚体形成。
（5）GC含量：引物的GC含量应在40-60%之间，以保证扩增效果和特异性。
3. 探针设计多重荧光定量PCR中可以选择使用探针进行定量分析。
探针的设计应遵循以下原则：（1）探针长度：探针长度通常在16-30个碱基之间，最好控制在20个碱基左右。
（2）探针Tm值：探针的Tm值应相似，通常要比引物的Tm 值高2-5℃。
（3）探针结构：选择合适的探针结构，常用的有TaqMan探针、MGB探针、Scorpion探针等。
根据实验需求选择合适的探针结构，以提高灵敏度和特异性。
4. 引物和探针的检测验证在设计引物和探针后，需要进行实验验证。
可以通过单引物和单探针PCR进行验证，检测目标序列的特异性和效果。
如果存在非特异性扩增或效果不理想，需要对引物和探针进行修改和优化。
总的来说，多重荧光定量PCR引物和探针的设计需要考虑靶标选择与设计、引物设计、探针设计以及引物和探针的检测验证等方面。
PCR引物及杂交探针设计
5. 碱基要随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶 核苷酸的成串排列。 6. 引物自身不能有连续4个碱基以上的互补。 7. 引物之间不能有连续4个碱基以上的互补。 8. 引物5′端可以修饰。 9. 引物3′端不可修饰。
重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得 更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可 成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4 分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大 几百万倍。（230=1073741824）
PCR反应五要素：
引物 酶 dNTP 模板 缓冲液（其中需要Mg2+)
PCR引物的设计原则
PCR
引 物 区 域 选 择
实时定量RT-PCR
实时定量PCR原理
所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系 中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个 PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量 分析的方法。
1. TaqMan荧光探针: PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的 荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬 灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收; PCR 扩增时，Taq酶的5'-3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭 荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA 链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全 同步。而新型TaqMan-MGB探针使该技术既可进行基因定量分析，又可分 析基因突变(SNP)，有望成为基因诊断和个体化用药分析的首选技术平台。
定量PCR引物探针设计原则完整版
定量P C R引物探针设计原则Document serial number【NL89WT-NY98YT-NC8CB-NNUUT-NUT108】定量PCR引物、探针设计原则自90年代Taqman探针诞生以来，虽然荧光探针（引物）不断有新的技术出现，但是作为一种经典的定量PCR技术，Taqman探针技术仍然是许多实验研究人员进行定量检测的首选，这主要是因为相对于SYBR荧光染料，Taqman探针具有序列特异性，只结合到互补区，而且荧光信号与扩增的拷贝数具有一一对应的关系，因此特异性强灵敏度高，而且条件优化容易；而相对于杂交探针，Taqman探针只要设计一条探针，因此探针设计较便宜方便，而且也能完成基本的定量PCR 要求。
当然Taqman定量方法由于还是要合成探针，也给实验操作带来了挑战。
一般Taqman定量PCR实验过程为：目的基因查找比对→探针与引物设计→探针与引物合成→配置反应体系→反应参数→重复实验，优化条件→获得曲线数据，比对标准曲线→再重复验证。
第一步：在第一步目的基因查找比对过程中可以利用NCBIgenbank序列以及DNAstar等软件完成目的DNA或者RNA的查找与比对——这在分析测序报告的时候相信很多人操作过，这一步需要注意的就是要保证所分析的序列在一个contig（重叠群，即染色体的一些区域中毗邻DNA片段重叠的情况）内。
第二步：如果其它条件一致，那么这个第二步——引物探针的设计就可以说是定量PCR成败的关键了，通过各方面经验的总结有以下几个基本的原则：总体原则先选择好探针，然后设计引物使其尽可能的靠近探针。
所选序列应该高度特异，尽量选择具有最小二级结构的扩增片段——这是因为二级结构会影响反应效率，而且还会阻碍酶的扩增。
建议先进行二级结构检测，如果不能避免二级结构，那么就要相应提高退火温度。
扩增长度应不超过400bp，理想的最好能在100-150bp内，扩增片段越短，有效的扩增反应就越容易获得。
荧光定量PCR技术
荧光定量PCR技术荧光定量PCR技术（Fluorescent Quantitative PCR，简称qPCR）是一种基于聚合酶链式反应（PCR）的多样性分析方法，它能够对DNA 分子进行定量分析。
本文将介绍荧光定量PCR技术的原理、优势以及应用领域。
一、原理荧光定量PCR技术是在常规PCR技术的基础上发展起来的，它通过添加与PCR产物相关联的荧光探针，利用荧光信号的定量变化来确定PCR反应中目标DNA的含量。
具体原理如下：1. 引物设计：根据目标DNA序列，设计一对特异性引物。
这两个引物分别作为PCR反应中的前向引物和反向引物，可以在PCR扩增的过程中特异性地结合到目标DNA序列的两端。
2. 荧光探针选择：为了检测PCR扩增产物的数量，需要选择一个荧光探针来标记目标DNA。
常用的荧光探针包括TaqMan探针、Molecular Beacons以及SYBR Green等。
3. 扩增过程：在PCR扩增过程中，前向和反向引物将目标DNA序列作为模板进行扩增。
同时，荧光探针与PCR扩增产物结合，并通过荧光信号被激发发出荧光。
4. 荧光检测：荧光定量PCR装置能够检测到荧光强度的变化，并根据标准曲线进行定量计算。
荧光信号的强度与PCR扩增产物的数量成正比。
二、优势荧光定量PCR技术相比于传统PCR技术具有以下优势：1. 高灵敏度：荧光定量PCR技术可以检测到极低浓度的目标DNA，其灵敏度通常可达到单拷贝水平。
2. 高特异性：由于设计特异性引物和荧光探针，荧光定量PCR技术对目标DNA的选择性很高，几乎不会产生假阳性结果。
3. 定量精确：通过荧光信号强度的定量变化，荧光定量PCR技术能够准确测定PCR扩增产物的数量，从而实现对目标DNA的定量分析。
4. 速度快：相比于传统的定量分析方法，荧光定量PCR技术的反应时间更短，结果可以在几个小时内得到。
三、应用领域荧光定量PCR技术在生物医学研究、疾病诊断和基因表达分析等领域得到了广泛的应用：1. 基因表达分析：荧光定量PCR技术可以定量检测不同基因在细胞或组织中的表达水平，为基因功能研究提供有力支持。
实时荧光定量PCR-TaqMan探针法及设计原则
Taqman MGB 探针设计
探针的5’端避免出现G，即使探针水解为单个碱基，与报告 基团相相连的G碱基仍可淬灭基团的荧光信号。
05 04 03
Tm值应为65-67℃。 尽量缩短Taqman MGB探针，但探针长度不少于碱基，应避免出现4个或 4个以上的G重复出现。
性； • 探针的DNA折叠和二级结构；尽量避开二级结构； • Tm值在65-70℃，通常比引物TM值高5-10℃（至少要5℃），
以确保在退火过程中探针先于引物与目的片段结合，GC含量在 40%－70%； • 探针的5’端应避免使用G鸟嘌呤——因为5'G会有淬灭作用， 而且即使是被切割下来还会存在淬灭作用； • 整条探针中，碱基C的含量要明显高于G的含量——G含量高会 降低反应效率，这时就应选择配对的另一条链作为探针； • 为确保引物探针的特异性，最好将设计好的序列在blast中核实 一次，如果发现有非特异性互补区，建议重新设计引物探针。
实时荧光定量PCR——TaqMan探针法
TaqMan技术引物设计原则
• 序列选取应在基因的保守区段； • 避免引物自身或与引物之间形成4个或4个以上连续配对，避免引
物自身形成环状发卡结构； • 典型的引物18到24个核苷长。引物需要足够长，保证序列独特性，
并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。 • Tm值在55－65℃，GC含量在40%－60%； • 引物之间的TM相差避免超过2℃； • 引物的3’端避免使用碱基A，引物的3’端避免出现3个或3个以
上连续相同的碱基； • 为避免基因组的扩增，引物设计最好能跨两个外显子； • Taqman探针技术要求片段长度在50bp－150bp； • 引物末端（最后5个核苷酸）不能有超过2个的G和C。
PCR和定量PCR的引物和探针设计
PCR和定量PCR的引物和探针设计PCR（聚合酶链反应）是一种用于扩增特定DNA序列的技术。
引物和探针是PCR中的关键组成部分，它们的设计对PCR的灵敏度和特异性至关重要。
引物是专门设计用于扩增目标DNA序列的两个短链DNA片段。
对于PCR反应的成功与否，引物的设计是至关重要的。
在引物设计中，以下几个因素需要考虑：1.引物长度：引物通常由18-24个碱基组成。
引物过短可能导致非特异扩增，而引物过长可能导致特异扩增低下。
2.引物序列：引物的序列应与目标DNA序列互补，以确保引物与目标序列之间的碱基配对。
避免引物序列中存在重复和寡聚核苷酸，以防止非特异扩增。
3.引物Tm值：引物的熔解温度（Tm）是引物与模板DNA断裂的温度。
引物的Tm值应相似，通常在50-65℃之间。
4.引物之间的互补性：引物之间应避免自身互补或与对方互补，以防止引物形成二聚体或无特异性扩增。
探针是一种带有荧光标记的SSO（特异性杂交寡核苷酸）或DSA（二链特异性杂交寡核苷酸），它能够检测到靶序列的扩增。
探针分为两类：探针（Hydrolysis Probes）和探针（Molecular Beacon Probes）。
1. 探针（Hydrolysis Probes）：这种探针包含一个与靶序列互补的引物和一个结合到引物上的荧光染料和一个淬灭器。
当DNA扩增反应进行时，引物与靶序列结合，使荧光染料与淬灭器距离远离，并发出荧光信号。
这种探针的设计需要考虑引物和探针之间的互补性，以确保特异性扩增和信号产生。
2. 探针（Molecular Beacon Probes）：这种探针是一段独特的DNA 或RNA序列，两端固定一个荧光染料和一个淬灭器。
当探针与靶序列结合时，形成一个折叠的结构，将荧光染料和淬灭器分开。
这种探针的设计需要考虑探针序列的互补性和结构的稳定性。
在引物和探针设计中1.特异性：引物和探针应与目标DNA序列具有高度特异性的互补性，避免与非目标DNA序列发生杂交。
定量PCR引物设计原则
定量PCR引物设计原则定量PCR是一种准确测量目标序列在样本中的数量的分子生物学技术。
与定性PCR不同，定量PCR能够提供目标序列的数量信息，因此在许多实验和临床应用中具有重要意义。
在进行定量PCR时，引物的设计是非常重要的因素之一、下面是一些定量PCR引物设计的原则：1.引物长度：引物的长度通常在18-25个碱基对之间。
较短的引物容易形成非特异性产物，而较长的引物则往往会降低PCR的效率。
2.引物序列选择：引物的序列应尽量选择在目标序列中的特异性区域，以确保引物能够特异性地结合目标序列而不结合其他非特异性序列。
可以通过比对目标序列与相关序列数据库来寻找特异性区域。
3.引物的GC含量：引物的GC含量通常应在40-60%之间。
较高的GC含量可以增加引物与目标序列的特异性结合，但同时也会增加引物之间的二聚体形成；较低的GC含量则可能会导致较差的引物与目标序列的匹配。
4.引物的熔解温度（Tm）：引物的熔解温度是指引物和目标序列形成稳定双链结构的温度。
引物的Tm应该尽可能接近PCR反应的最佳温度，一般在50-65摄氏度之间。
可以使用在线工具来预测引物的Tm值。
5.引物之间的互补性：引物之间的互补性会导致引物二聚体的形成，从而降低PCR效率。
因此，在设计引物时，应该避免引物之间互补性的存在。
6.引物的扩增效率：在定量PCR中，引物的扩增效率是非常重要的。
扩增效率低的引物会导致不准确的目标序列定量结果。
可以通过序列分析或前期实验来评估引物的扩增效率，并选择高效的引物进行反应。
7.引物与非特异性产物的区别：引物设计时应尽量避免与非特异性产物的区域重叠，以减少非特异性扩增的可能性。
可以通过序列比对和预测工具来评估引物与非特异性产物的区别。
8.引物的检测精度：定量PCR的精度取决于引物的特异性。
应尽量选择能够特异性地放大目标序列的引物，以避免误差的积累。
总之，定量PCR引物的设计原则是尽可能选择特异性序列作为目标，并且要注意引物长度、GC含量、熔解温度、互补性、扩增效率、与非特异性产物的区别以及检测精度。
定量pcr的原理和应用
定量PCR的原理和应用一、定量PCR的概述定量PCR（Quantitative PCR，简称qPCR）是一种用于精确测定DNA或RNA 在样本中的相对或绝对数量的技术。
相比传统的定性PCR，定量PCR能提供更加准确和可靠的分子生物学定量分析结果。
本文将介绍定量PCR的原理、方法和应用。
二、定量PCR的原理定量PCR基于传统PCR技术，通过测量PCR产物的实时累积情况来确定起始模板的数量。
其主要原理包括：1.设计引物和探针：定量PCR需要使用特异性引物和荧光探针来扩增和检测目标序列，引物的设计应考虑碱基配对的特异性和温度互补性。
2.实时检测：在PCR反应过程中，荧光探针与目标序列发生特异性结合，形成荧光信号。
通过实时监测PCR产物的荧光信号强度，可以确定目标序列的起始数量。
3.标准曲线法：定量PCR通常需要构建标准曲线来确定目标序列的起始数量。
标准曲线是由一系列已知起始数量的标准品制备而成，根据标准曲线上的荧光信号强度和已知起始数量的关系，可以推断出未知样本中目标序列的起始数量。
三、定量PCR的步骤定量PCR通常包括以下步骤：1.样本处理：将待测样本中的DNA或RNA提取和纯化，以获得高质量的核酸模板。
2.引物和探针设计：根据目标序列的特异性和相关基因信息，设计引物和荧光探针。
3.PCR反应体系的配置：根据实验需求和PCR仪器要求，配置PCR反应混合液，包括引物、荧光探针、DNA模板和PCR反应缓冲液等。
4.PCR反应条件的设置：确定PCR反应的温度和时间参数，包括退火温度、延伸时间和扩增周期数等。
5.实时荧光监测：将PCR反应体系加载到实时荧光PCR仪中，监测PCR反应过程中荧光信号的强度变化。
6.数据分析：利用实时荧光PCR仪软件对荧光信号数据进行分析，绘制标准曲线和计算目标序列的起始数量。
四、定量PCR的应用定量PCR在生物学研究和临床诊断中具有广泛的应用。
以下是定量PCR的主要应用领域：1.基因表达分析：通过定量PCR可以测定不同组织或细胞中特定基因的表达水平，揭示基因在生物学过程中的功能和调控机制。
PCR引物和探针
引物设计原则：1．上下游引物要保守为了能够扩增出所需要的保守片段，必须对保守的100-200 片段进行PCR 扩增。
所以引物的选取也要非常的保守。
2•上下游引物的长度一般为18-30bp之间，且Tm值在58-62 C之间，上下游引物的Tm值相差最好不超过2C。
3．确保引物中 GC 含量在 30-80% 。
应避免引物中多个重复的碱基出现，尤其是要避免4个或超过4个的G碱基出现。
引物的3'端最好不为G或/和C。
引物3'端的5个碱基不应出现2个G或/和C o4．避免引物内出现反向重复序列形成发夹二级结构，同时也应避免引物间配对形成引物二聚体。
5•跨外显子设计引物，用于区别或消除基因组DNA的扩增。
探针设计的基本原则：1. 保守：探针要绝对的保守，有时分型就仅仅依靠探针来决定。
理论上有一个碱基不配对，就可能检测不出来。
2. Taqman探针的长度最好在25-32bp之间，且Tm值在68-72 C之间，确保探针的Tm值要比引物的Tm值高出5-10 °C，这样可保证探针在退火时先于引物与目的片段结合。
3. 确保探针中 GC 含量在 30-80% o4. 避免探针中多个重复的碱基出现，尤其是要避免 4个或超过4个的G碱基5. 探针的5 '端不能为G，因为即使单个G碱基与FAM荧光报告基团相连时，也可以淬灭FAM基团所发出的荧光信号，从而导致假阴性的出现。
6. Taqman 探针应靠近上游引物，即 Taqman 探针应靠近与其在同一条链上的上游引物。
两者的距离最好是探针的5'端离上游引物的3'有一个碱基。
7. 避免探针与引物之间形成二级结构。
8. 对于多重定量PCR，例如SNP分型检测时，SNP位点应设计在探针的中间位置，并且两种探针的Tm值应相近。
定量PCR 引物、探针设计原则
定量PCR 引物、探针设计原则自90年代Taqman探针诞生以来，虽然荧光探针（引物）不断有新的技术出现，但是作为一种经典的定量PCR技术，Taqman探针技术仍然是许多实验研究人员进行定量检测的首选，这主要是因为相对于SYBR荧光染料，Taqman探针具有序列特异性，只结合到互补区，而且荧光信号与扩增的拷贝数具有一一对应的关系，因此特异性强灵敏度高，而且条件优化容易；而相对于杂交探针，Taqman探针只要设计一条探针，因此探针设计较便宜方便，而且也能完成基本的定量PCR要求。
当然Taqman定量方法由于还是要合成探针，也给实验操作带来了挑战。
一般Taqman定量PCR实验过程为：目的基因查找比对→探针与引物设计→探针与引物合成→目的DNA第二步：保持GC）?典型的引物18到24个核苷长。
引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。
但是长度大于24核苷的引物并不意味着更高的特异性。
较长的序列可能会与错误配对序列杂交，降低了特异性，而且比短序列杂交慢，从而降低了产量。
Tm值在55－65℃（因为60℃核酸外切酶活性最高），GC含量在40%－60%引物之间的TM相差避免超过2℃引物的3’端避免使用碱基A，引物的3’端避免出现3个或3个以上连续相同的碱基为避免基因组的扩增，引物设计最好能跨两个外显子。
Taqman探针技术要求片段长度在50bp－150bp?引物末端（最后5个核苷酸）不能有超过2个的G和C。
?探针设计原则探针位置尽可能地靠近上游引物探针长度应在15-45bp（最好是20-30bp)，以保证结合特异性检测探针的DNA折叠和二级结构Tm值在65-70℃，通常比引物TM值高5-10℃（至少要5℃），GC含量在40%－70%探针的5’端应避免使用G鸟嘌呤——因为5'G会有淬灭作用，而且即使是被切割下来还会存在淬灭作用。
整条探针中，碱基C的含量要明显高于G的含量——G含量高会降低反应效率，这时就应选择配对的另一条链作为探针。
定量PCR引物探针设计原则
定量PCR引物探针设计原则1.引物长度：最好控制在18-25个碱基对之间。
过短的引物会导致特异性降低，而过长的引物则会增加杂交的机会，影响PCR的特异性。
2.引物序列：引物应与目标基因序列高度匹配，避免引物与非特异性DNA结合。
引物的GC含量应在40-60%之间，以确保适当的结合力。
3.引物互补性：引物设计时，互补性不应超过3个碱基对。
互补性太高可能会导致杂交产物增多，影响PCR的特异性。
4.引物Tm值：引物的熔解温度（Tm）应在55-65°C之间。
Tm值过高可能导致引物与非特异性DNA杂交，而Tm值过低可能导致引物无法精确结合目标DNA。
5.引物的位置：引物应设计在目标基因的保守区域，避免设计在多态性位点或重复序列区域。
1.引物-探针互补性：引物和探针应该具有很高的互补性，以确保探针与引物结合后能够产生一个稳定的引物-探针结合物。
2.探针设计：探针通常由一个荧光染料和一个QSY抑制剂构成。
荧光染料的选择应是稳定的、不受PCR反应条件的影响的。
QSY抑制剂充当了探针的标记基团，它通过修饰荧光染料对荧光信号进行猝灭。
3.探针-引物适配性：探针和引物之间应该是完全互补的，以确保引物和探针都能够准确结合目标DNA，并且防止任何非特异性杂交的发生。
4.简并位点：在设计探针时应避免引物和探针设计在简并位点上，这样可以确保在PCR过程中特异性扩增。
5.荧光信号强度：探针设计时还应考虑荧光信号的强度。
一般而言，较强的荧光信号会导致更高的检测灵敏度，但较低的信号可能会增加误差。
总而言之，定量PCR引物和探针的设计需要遵循一系列原则，以确保可靠性和准确性。
这些原则包括引物长度、序列、互补性和Tm值的控制，引物的位置选择以及荧光染料和QSY抑制剂的合理选择和设计。
通过遵循这些原则，可以提高定量PCR的特异性和灵敏度，并准确测量样本中的目标基因表达水平。
实时荧光定量PCR-TaqMan探针法及设计原则
03
Taqman探针的合成与制备
探针的合成方法
化学合成法
通过化学反应将荧光基团和淬灭基团分别连接到DNA或RNA的5'和3'末端，形成 Taqman探针。
酶促合成法
利用DNA聚合酶将荧光基团和淬灭基团分别添加到DNA或RNA的特定位置，形成 Taqman探针。
探针的质量检测与纯化
质量检测
通过电泳、质谱和光谱分析等方法检测探针 的长度、荧光基团和淬灭基团的数量和位置 ，以及探针的纯度。
定义与原理
定义
实时荧光定量PCR-Taqman探针法是 一种基于荧光信号的实时监测技术， 用于定量分析DNA或RNA的拷贝数。
原理
通过在Taq酶催化下，利用荧光染料 标记的特异性探针与待测核酸进行特 异性结合，在PCR循环过程中实时监 测荧光信号的增强，从而实现对核酸 的定量分析。
发展历程与现状
02
Taqman探针的设计原则
探针的长度与结构
长度
通常为20-30bp，确保特异性并减少非特异性扩增。
结构
由报告基团、淬灭基团和连接臂组成，连接臂长度一般为5-6个脱氧核糖核苷酸。
探针的特异性
针对目标序列
确保探针与目标序列完全匹配，避免 交叉反应。
序列选择
选择基因特异性区域，避免基因组中 的高变区。
04
Taqman探针在实时荧光定量 PCR中的应用
样本处理与PCR反应体系建立
样本处理
确保样本质量，去除杂质和抑制剂，提 取高质量的DNA或RNA。
Taqman探针设计
根据目标基因序列设计Taqman探针， 确保探针的特异性和荧光信号的稳定
性。
引物设计
根据目标基因序列设计特异性引物， 确保引物与模板的结合效率和特异性。
PCR和定量PCR的引物和探针设计
PCR和定量PCR的引物和探针设计PCR（聚合酶链反应）和定量PCR（实时荧光定量聚合酶链反应）是现代分子生物学中常用的实验技术，用于扩增和检测DNA序列。
在 PCR和定量 PCR 中，引物（primers）和探针（probes）的设计是非常重要的，因为它们直接影响到实验的灵敏度和特异性。
引物是一对短的DNA分子，通常由15-30个核苷酸组成，它们会被限制性酶切割出位于目标序列两端的DNA片段。
引物的设计需遵循以下几个原则：1.引物的碱基组成：引物应具有合适的碱基组成。
GC含量较高的引物有更强的互补性和比特性，但也更容易形成二聚体，影响PCR反应的特异性和效率。
通常引物的GC含量应在40%-60%之间。
2.引物的长度：引物的长度应在18-28个碱基对之间。
引物过短会导致扩增产物的非特异性，引物过长会降低扩增效率。
3. 引物的 Tm 值： Tm 值（熔解温度）是指引物与模板 DNA 结合时解链的温度。
引物的 Tm 值应保持一致，一般在55°C - 65°C 之间。
在设计扩增子（amplifier）时，引物的 Tm 值差异应在1°C 以内，以确保扩增的特异性。
探针是一种特殊的分子，它包含一个与目标序列完全互补的引物序列和一个荧光染料分子。
探针的设计需遵循以下几个原则：1. 荧光染料的选择：选择一个与实验设备所能感测的波长相适应的荧光染料。
常见的荧光染料有荧光素（Fluorescein）、荧光素异硫氰酯（FITC）以及羧基甲基罗damine（ROX）等。
2. Quencher 的选择：设定探针的Quencher。
一般使用的Quencher是BHQ1，或者参考其他文献上的Quencher的讯息。
3.引物和探针的序列：引物和探针的序列应与目标序列完全互补。
引物和探针的设计应尽量避免任意位置出现连续的鸟嘌呤（G）或者鸟嘧啶（C），以避免互结和三聚体的形成。
4.引物和探针的位置：引物和探针的位置非常重要。
pcr荧光探针法原理
pcr荧光探针法原理PCR荧光探针法是一种检测基因的方法，它利用聚合酶链式反应（PCR）技术和荧光标记探针的特性来检测目标序列的存在和数量。
其原理如下：1. 设计引物：首先根据目标序列的DNA序列设计两个引物，一个位于目标序列起始位置的5'端，另一个位于目标序列末端的3'端。
这两个引物将在PCR反应中作为DNA合成的起始点。
2. 设计荧光探针：接下来设计荧光标记的探针，通常是由一段与目标序列互补的DNA序列和一种荧光染料以及一个与染料不相互作用的猝灭剂组成。
当探针与目标序列结合时，猝灭剂与荧光染料相互作用，使荧光信号无法被探测到。
3. PCR反应：将样本DNA与引物和荧光探针一起加入PCR反应体系中，通过多次的温度循环，使目标序列的数量指数级增加。
在每个循环的延伸阶段，DNA聚合酶将开始合成新的DNA链，其中也包括目标序列。
4. 检测信号：在PCR反应过程中，荧光探针与目标序列结合后会被DNA聚合酶附近的核酸酶消化，猝灭剂失去与荧光染料的相互作用，导致荧光信号被释放出来。
这个信号可以通过荧光定量PCR仪器来检测和记录。
5. 数据分析：通过比较荧光信号的强度，可以判断目标序列的存在与否。
若目标序列在样本中存在，荧光信号将逐渐增加；若目标序列不存在，荧光信号将保持较低的水平。
根据荧光信号的量化结果，可以计算出目标序列在样本中的数量。
总之，PCR荧光探针法通过PCR反应扩增目标序列，并通过荧光信号来判断目标序列的存在和数量。
该方法具有高灵敏度、高特异性和实时监测的特点，被广泛应用于基因检测、病原体鉴定和遗传疾病诊断等领域。
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精心整理定量PCR引物、探针设计原则
自90年代Taqman探针诞生以来，虽然荧光探针（引物）不断有新的技术出现，但是作为一种经典的定量PCR技术，Taqman探针技术仍然是许多实验研究人员进行定量检测的首选，这主要是
因为相对于SYBR荧光染料，Taqman探针具有序列特异性，只结合到互补区，而且荧光信号与扩增
的拷贝数具有一一对应的关系，因此特异性强灵敏度高，而且条件优化容易；而相对于杂交探针，Taqman探针只要设计一条探针，因此探针设计较便宜方便，而且也能完成基本的定量PCR要求。
当然Taqman定量方法由于还是要合成探针，也给实验操作带来了挑战。
一般Taqman定量PCR实验过程为：目的基因查找比对→探针与引物设计→探针与引物合成→
配置反应体系→反应参数→重复实验，优化条件→获得曲线数据，比对标准曲线→再重复验证。
第一步：在第一步目的基因查找比对过程中可以利用NCBIgenbank序列以及DNAstar等软件完成目的DNA或者RNA的查找与比对——这在分析测序报告的时候相信很多人操作过，这一步需要注意的就是要保证所分析的序列在一个contig（重叠群，即染色体的一些区域中毗邻DNA片段重叠的情况）内。
第二步：如果其它条件一致，那么这个第二步——引物探针的设计就可以说是定量PCR成败的关键了，通过各方面经验的总结有以下几个基本的原则：
总体原则
先选择好探针，然后设计引物使其尽可能的靠近探针。
所选序列应该高度特异，尽量选择具有最小二级结构的扩增片段——这是因为二级结构会影响
反应效率，而且还会阻碍酶的扩增。
建议先进行二级结构检测，如果不能避免二级结构，那么就要相应提高退火温度。
扩增长度应不超过400bp，理想的最好能在100-150bp内，扩增片段越短，有效的扩增反应就越容易获得。
较短的扩增片段也容易保证分析的一致性。
保持GC含量在20％和80％之间，GC富含区容易产生非特异反应，从而会导致扩增效率的降低，
以及出现在荧光染料分析中非特异信号。
为了保证效率和重复性，应避免重复的核苷酸序列，尤其是G（不能有4个连续的G）
将引物和探针互相进行配对检测，以避免二聚体和发卡结构的形成。
引物设计原则
序列选取应在基因的保守区段
避免引物自身或与引物之间形成4个或4个以上连续配对，避免引物自身形成环状发卡结构典型的引物18到24个核苷长。
引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。
但是长度大于24核苷的引物并不意味着更高的特异性。
较长的序列可能会与
错误配对序列杂交，降低了特异性，而且比短序列杂交慢，从而降低了产量。
Tm值在55－65℃（因为60℃核酸外切酶活性最高），GC含量在40%－60%
引物之间的TM相差避免超过2℃
引物的3’端避免使用碱基A，引物的3’端避免出现3个或3个以上连续相同的碱基
为避免基因组的扩增，引物设计最好能跨两个外显子。
Taqman探针技术要求片段长度在50bp－150bp
引物末端（最后5个核苷酸）不能有超过2个的G和C。