定量PCR引物、探针设计原则

精心整理定量PCR引物、探针设计原则

自90年代Taqman探针诞生以来，虽然荧光探针（引物）不断有新的技术出现，但是作为一种经典的定量PCR技术，Taqman探针技术仍然是许多实验研究人员进行定量检测的首选，这主要是

因为相对于SYBR荧光染料，Taqman探针具有序列特异性，只结合到互补区，而且荧光信号与扩增

的拷贝数具有一一对应的关系，因此特异性强灵敏度高，而且条件优化容易；而相对于杂交探针，Taqman探针只要设计一条探针，因此探针设计较便宜方便，而且也能完成基本的定量PCR要求。当然Taqman定量方法由于还是要合成探针，也给实验操作带来了挑战。

一般Taqman定量PCR实验过程为：目的基因查找比对→探针与引物设计→探针与引物合成→

配置反应体系→反应参数→重复实验，优化条件→获得曲线数据，比对标准曲线→再重复验证。

第一步：在第一步目的基因查找比对过程中可以利用NCBIgenbank序列以及DNAstar等软件完成目的DNA或者RNA的查找与比对——这在分析测序报告的时候相信很多人操作过，这一步需要注意的就是要保证所分析的序列在一个contig（重叠群，即染色体的一些区域中毗邻DNA片段重叠的情况）内。

第二步：如果其它条件一致，那么这个第二步——引物探针的设计就可以说是定量PCR成败的关键了，通过各方面经验的总结有以下几个基本的原则：

总体原则

先选择好探针，然后设计引物使其尽可能的靠近探针。

所选序列应该高度特异，尽量选择具有最小二级结构的扩增片段——这是因为二级结构会影响

反应效率，而且还会阻碍酶的扩增。建议先进行二级结构检测，如果不能避免二级结构，那么就要相应提高退火温度。

扩增长度应不超过400bp，理想的最好能在100-150bp内，扩增片段越短，有效的扩增反应就越容易获得。较短的扩增片段也容易保证分析的一致性。

保持GC含量在20％和80％之间，GC富含区容易产生非特异反应，从而会导致扩增效率的降低，

以及出现在荧光染料分析中非特异信号。

为了保证效率和重复性，应避免重复的核苷酸序列，尤其是G（不能有4个连续的G）

将引物和探针互相进行配对检测，以避免二聚体和发卡结构的形成。

引物设计原则

序列选取应在基因的保守区段

避免引物自身或与引物之间形成4个或4个以上连续配对，避免引物自身形成环状发卡结构典型的引物18到24个核苷长。引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。但是长度大于24核苷的引物并不意味着更高的特异性。较长的序列可能会与

错误配对序列杂交，降低了特异性，而且比短序列杂交慢，从而降低了产量。

Tm值在55－65℃（因为60℃核酸外切酶活性最高），GC含量在40%－60%

引物之间的TM相差避免超过2℃

引物的3’端避免使用碱基A，引物的3’端避免出现3个或3个以上连续相同的碱基

为避免基因组的扩增，引物设计最好能跨两个外显子。

Taqman探针技术要求片段长度在50bp－150bp

引物末端（最后5个核苷酸）不能有超过2个的G和C。