第三章 细胞生物学研究方法

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二、课时教学内容第页

技术的进步在一门学科的建立与发展过程中起着巨大的作用。没有

显微镜的发明就没有细胞的发现，更不会有细胞学说的建立，没有电子显微技术及其分子生物学技术的结合，就不会有细胞生物学今天的发展。

细胞生物学研究方法：一般来说，凡是用来解决细胞生物学问题所采用的方法，都属于细胞生物学研究方法。当前细胞生物学研究中常用到的方法有:核酸和蛋白质成分的分析和序列测定、研究特异DNA、RNA常用的southern 杂交、Northwre杂交及蛋白质免疫印迹技术、基因打靶技术等等。

第一节细胞形态结构的观察方法

一、有关显微镜的一些概念

（1）分辨率（resolution）：指分辨物体最小间隔的能力。

光学显微镜的分辨率R=0.61λ/N．sin（α/2）．

▪其中λ为入射光线波长；

▪N =介质折射率；空气中N =1

▪α=物镜镜口角（样品对物镜镜口的张角）。

（2）放大倍数（magnification）：是指眼睛看到像的大小与对应标本大小的比值。它指的是长度的比值而不是面积的比值。

例：放大倍数为100×，指的是长度是1μm的标本，放大后像的长度是100μm，要是以面积计算，则放大了10,000倍。

显微镜的总放大倍数等于物镜和目镜放大倍数的乘积。

（3）有效放大倍数（effective magnification）：物镜的数值孔径（NA）决定了显微镜有效放大倍数。有效放大倍数，就是人眼能够分辨的d′与物镜的d间的

显微镜。这两类显微镜又可根据不同的情况分成若干类型。

三、光学显微镜技术

光学显微镜技术至今仍是细胞生物学研究的重要手段。

（一）普通复式光学显微镜技术

1. 构成：

①照明系统：光源、折光镜、聚光镜

②光学放大系统：为两组玻璃透镜，目镜与物镜

③机械装置和支架系统，由镜座、镜筒、物镜转换器、载物台、推动器、粗

动螺旋和微动螺旋等部件组成，保证光学系统的准确配置和灵活调控。

2. 原理：经物镜形成倒立实像，经目镜放大成虚像。

教学内容小结

（二）相差和微分干涉显微镜技术

光线在通过密度不同的介质时，其滞留程度不同，即产生了光程差和相位差。

相差显微镜的基本原理把光程差变成振幅差(即明暗)。从而提高样品反差，提

高了各种结构间的对比度，明暗差别通过密度差形成

使各种结构变得清晰可见。用途：观察未经染色的玻片标本，样品不需染色，

适合观察活细胞。甚至研究细胞核、线粒体等细胞器的动态。

在构造上，相差显微镜有不同于普通光学显微镜两个特殊之处。

1.环形光阑（annular diaphragm）：位于光源与聚光器之间。

2.相位板（annular phaseplate）：物镜中加了涂有氟化镁的相位板，可将直

射光或衍射光的相位推迟1/4λ。

微分干涉显微镜用的是偏振光，增加了样品反差，并具有立体感，可作于

研究活体细胞中较大的细胞器。

教学内容小结（三）荧光显微镜技术

特点：光源为短波光；

有两个特殊的滤光片（激发光滤片，阻断滤片）

照明方式通常为落射式（这种照明的光束来自物体的上方通过物镜后射到

被检物体上，这样物镜又起着聚光镜的作用。这种照明法是适用于非透明物体，

检出能力高；对细胞的刺激小；能进行多重染色）。

原理：细胞中有些物质，如叶绿素等，受紫外线照射后可发荧光；另有一

些物质本身虽不能发荧光，但如果用荧光染料或荧光抗体染色后，经紫外线照

射亦可发荧光，荧光显微镜可对这类物质进行定性和定量研究。光源为紫外光，

波长较短，分辨力高于普通显微镜。是目前在光镜水平用于特异蛋白质等生物

大分子的定性定位最有力的工具

应用：直接荧光标记技术

间接免疫荧光标记技术

（四）激光共聚焦显微技术

原理和应用：激光共聚焦扫描显微镜（laser confocal scanning microscope）

分辨力0.2nm，放大倍数可达106；

用于观察超微结构（小于0.2µm）。

（二）主要电镜制备技术

1、超薄切片技术

用于电镜观察的样本制备。通常以锇酸和戊二醛固定样品，以环氧树脂包埋，以热膨胀或螺旋推进的方式推进样品切片，切片厚度20-50nm。

由于电子束的穿透能力有限，为获得高分辨率的图像，切片厚度一般仅为40-50nm，即一个直径为20um的细胞可以切成几百片，故称超薄切片。这需要样品具备一定的刚性和韧性，而生物样品不具备这些特性，因此需要包埋于特殊的介质中，包埋时会破坏样品的结构，因此在包埋前必须先将样品固定。（1）固定：保持样品的真实性，细胞内部结构和成分保持在原来位置上通常以锇酸和戊二醛固定样品，低温，防止酶的自溶而破坏样品结构。（2）包埋：各种细微结构在切片过程中获得均匀良好的支撑，使获得的超薄切片连续完整并有足够的强度，且能耐受观察时的电子轰击、高温和真空挥发。常用的包埋剂为环氧树脂。注意：生物样品固定后仍含有大量水分，而包埋剂是与谁不相溶的，因此在包埋前通常需要一系列的脱水处理。

（3）切片：通过样品杆的金属热膨胀或机械伸缩控制切片厚度。

切片刀：玻璃或砖石。切片需捞在覆有支撑膜的载网上才能在电镜下观察。（4）染色：用重金属盐染色以形成明暗反差，只能观察到黑白图像

不同的成分对不同的燃料有不同的亲和性：锇酸—脂质；铅盐—蛋白质；醋酸铀

扫描电子显微镜于20世纪60年代问世，用来观察标本的表面结构。工作

原理是用一束极细的电子束扫描样品，在样品表面激发出次级电子，次级电子

的多少与电子束入射角有关，也就是说与样品的表面结构有关，次级电子由探

测体收集，并在那里被闪烁器转变为光信号，再经光电倍增管和放大器转变为

电信号来控制荧光屏上电子束的强度，显示出与电子束同步的扫描图像。图像

为立体形象，反映了标本的表面结构。为了使标本表面发射出次级电子，标本

在固定、脱水后，要喷涂上一层重金属微粒，重金属在电子束的轰击下发出次

级电子信号。CO 2临界点干燥法防止引起样品变形的表面张力问题。

五、扫描隧道显微镜（STM）

它于1981年由格尔德·宾宁(Gerd K.Binnig)及亨利希·罗勒(Heinrich Rohrer)在IBM位于瑞士苏黎世的苏黎世实验室发明扫描隧道显微镜，只一种在

纳米水平上探测微观世界物质表面形貌的一仪器。

原理：扫描探针与样品接触或达到很近距离时，即产生彼此间相互作用力，

如量子力学中的隧道效应（隧道电流）、原子间作用力、磁力、摩擦力等，并在

教学内容小结计算机显示出来，从而反映出样品表面形貌信息、电特性或磁特性等。

主要装置：

►X YZ方向扫描的压电陶瓷、

►逼近装置、

►电子学反馈控制系统、

►数据采集、处理和显示系统