细胞凋亡与免疫讲解
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• 继发性坏死(secondary necrosis)：
在体外诱导细胞凋亡时，由于没有巨噬细胞吞噬凋 亡小体，凋亡小体会发生继发性坏死。体内也有发 现，机制不明。
细胞凋亡的生化改变
• 胞浆[Ca2+]升高，pH降低；
• 内源性Ca2+/Mg2+依赖性核酸内切酶激活， Zn2+是其抑制剂；
• 生物大分子的合成。但CTL、NK细胞释放 的颗粒酶诱导的靶凋亡无需新的RNA和蛋 白的合成；
Annexin V Assay
DNA Cycle Assay
DNA Ladder
DNA Ladder
TUNEL法
细胞凋亡的分期
• 诱导期：凋亡诱导因素作用于细胞后，细胞通过复 杂信号转导途径将信号传入胞内，由细胞决定生存 或死亡；
• 执行期：决定死亡的细胞将按预定程序启动凋亡， 激活凋亡所需的各种酶类及降解相关物质，形成凋 亡小体；
The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2002
H. Robert Horvitz
Sydney Brenner
John E. Sulston
课程内容
• 凋亡的概念； • 凋亡的形态学特征和生化改变； • 凋亡的检测； • 凋亡的分期； • 凋亡的诱导因素和抑制因素； • 凋亡的生物学意义 • 凋亡相关基因； • 免疫相关的凋亡信号转导； • 凋亡与免疫生理； • 凋亡与免疫病理。
细胞凋亡的检测
• 细胞凋亡的形态学检测； • 磷脂酰丝氨酸外翻分析(Annexin V法)； • 流式细胞仪检测细胞凋亡； • DNA片断化检测； • 脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法
(terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL)。
• 细胞核的变化：
1. 染色质浓缩，形成染色质块，并聚集在核 膜的边缘，呈新月形、马蹄形或舟状分布， 称为染色质边聚(margination)；或聚集在核 中央，称为染色质中聚。
2. 随着染色质进一步聚集，核纤层断裂消失， 核膜在核膜孔处断裂，两断端向内包裹将 聚集的染色质块分割，形成若干个核残块。
Apoptosis and necrosis
• ห้องสมุดไป่ตู้胞凋亡是指细胞在一定的生理或病理条件 下，遵循自身的程序，由基因调控的主动的 死亡过程。它是一个主动的，高度有序的， 基因控制的，一系列酶参与的过程。
• 细胞坏死是由于某些外界的因素，如局部贫 血、高热以及物理、化学损伤和生物的侵袭 等，造成细胞急速死亡而结束其生命。
与胞膜融合，形成膜表面的芽状突起，称 为出芽(budding)。
细胞凋亡中细胞膜的变化
• 细胞质的变化：
1. 胞质浓缩：由于胞质脱水而导致细胞皱缩、 致密及固缩(condensation)，是细胞凋亡形 态学变化的一大特征；
2. 细胞器变化：线粒体变大，嵴增多，增殖 并空泡化。内质网腔扩大、增殖并在凋亡 细胞形成自噬体过程中提供包裹膜。其他 多数细胞器完整存在，变得致密。
• 消亡期：凋亡的细胞被邻近的巨噬细胞所吞噬并在 巨噬细胞内降解。
细胞凋亡的分期
凋亡小体的吞噬
• 巨噬细胞上的分子： ABC1 (the class A scavenger receptors); CD36 (the class B scavenger receptors); CD14 (the class B scavenger receptors); αvβ3-integrin (the vitronectin receptor).
HeLa细胞凋亡过程中核染色质的形态学变化
Confocal观察HeLa细胞凋亡过程中的 FITC-Annexin V和PI染色
流式细胞仪检测细胞凋亡
• 在凋亡发生的各个过程当中，都有相应的 流式细胞仪的检测方法，可以采用以下检 测方法： 1、线粒体功能 2、DNA Cycle 3、Caspases 4、Annexin V Assay 5、DNA Fragmentation Assays
细胞凋亡与免疫
细胞凋亡的发现及发展历史
• 1842年，Vogt发现一种不同于细胞坏死的细胞 死亡现象。
• 1887年，Flemming将对这种细胞死亡做了形 态描述。
• 1972年，Kerr首次提出细胞凋亡的概念。
• 1973年，首次在细胞凋亡中发现DNA的降解。
• 今天，细胞凋亡进入分子阶段的研究，近几年已 进入临床应用阶段。
• 线粒体内膜的跨膜电位降低、呼吸链受损、 ATP生成减少、细胞活性氧(ROS)产生增多、 线粒体通透性转换孔(permeability transition pore, PTP)开放和线粒体膜通透性增高，导致 线粒体内的细胞色素C、凋亡诱导因子 (apoptosis inducing factor,AIF)、凋亡蛋白酶 激活因子(apoptotic protease activating factor， Apaf)等凋亡启动因子释放入胞浆。从而诱导 细胞凋亡。
• 凋亡小体形成：
胞膜皱缩内陷，分割包裹胞质，内含DNA物 质及细胞器，形成泡状小体称为凋亡小体 (apoptosis body)，这是凋亡细胞特征性的形 态学改变。凋亡小体呈圆形、椭圆形或不规 则状，小体内的成份主要是胞质、细胞器和 核碎片。
• 吞噬：
凋亡小体形成后，邻近巨噬细胞识别由细胞膜内侧 转移到外侧的磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine, PS)， 并吞噬和消化凋亡小体。整个凋亡过程没有细胞内 容物的外漏，因而不伴有局部的炎症反应。
细胞凋亡与坏死的比较
坏死
性质
病理性
生化特点 被动过程，无新蛋白合成，
不耗能
细胞数量 成群细胞死亡，组织损伤
细胞形状
破裂成碎片
形态变化 细胞肿胀、破坏、细胞结构
全面溶解
染色质 稀疏、分散、呈絮状
DNA电泳 随机降解，电泳呈弥漫条带
炎症反应 溶酶体破裂，局部炎症反应
基因调控
无
潜伏期
无
凋亡 生理性或病理性 主动过程，有新蛋白会成，
耗能 单个细胞丢失 形成凋亡小体 细胞膜及细胞器相对完整， 细胞皱缩，核固缩 致密、固缩、边集或中集 DNA片段化( 80-200bp)， 电泳呈梯状条带 溶酶体相对完整，局部无炎 症反应
有 数小时
细胞凋亡与坏死的形态变化
细胞凋亡的形态学变化
• 细胞膜的变化： 1. 微绒毛、细胞突起和细胞表面皱褶消失； 2. 胞膜迅速发生空泡化，内质网不断扩张并
在体外诱导细胞凋亡时，由于没有巨噬细胞吞噬凋 亡小体，凋亡小体会发生继发性坏死。体内也有发 现，机制不明。
细胞凋亡的生化改变
• 胞浆[Ca2+]升高，pH降低；
• 内源性Ca2+/Mg2+依赖性核酸内切酶激活， Zn2+是其抑制剂；
• 生物大分子的合成。但CTL、NK细胞释放 的颗粒酶诱导的靶凋亡无需新的RNA和蛋 白的合成；
Annexin V Assay
DNA Cycle Assay
DNA Ladder
DNA Ladder
TUNEL法
细胞凋亡的分期
• 诱导期：凋亡诱导因素作用于细胞后，细胞通过复 杂信号转导途径将信号传入胞内，由细胞决定生存 或死亡；
• 执行期：决定死亡的细胞将按预定程序启动凋亡， 激活凋亡所需的各种酶类及降解相关物质，形成凋 亡小体；
The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2002
H. Robert Horvitz
Sydney Brenner
John E. Sulston
课程内容
• 凋亡的概念； • 凋亡的形态学特征和生化改变； • 凋亡的检测； • 凋亡的分期； • 凋亡的诱导因素和抑制因素； • 凋亡的生物学意义 • 凋亡相关基因； • 免疫相关的凋亡信号转导； • 凋亡与免疫生理； • 凋亡与免疫病理。
细胞凋亡的检测
• 细胞凋亡的形态学检测； • 磷脂酰丝氨酸外翻分析(Annexin V法)； • 流式细胞仪检测细胞凋亡； • DNA片断化检测； • 脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法
(terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL)。
• 细胞核的变化：
1. 染色质浓缩，形成染色质块，并聚集在核 膜的边缘，呈新月形、马蹄形或舟状分布， 称为染色质边聚(margination)；或聚集在核 中央，称为染色质中聚。
2. 随着染色质进一步聚集，核纤层断裂消失， 核膜在核膜孔处断裂，两断端向内包裹将 聚集的染色质块分割，形成若干个核残块。
Apoptosis and necrosis
• ห้องสมุดไป่ตู้胞凋亡是指细胞在一定的生理或病理条件 下，遵循自身的程序，由基因调控的主动的 死亡过程。它是一个主动的，高度有序的， 基因控制的，一系列酶参与的过程。
• 细胞坏死是由于某些外界的因素，如局部贫 血、高热以及物理、化学损伤和生物的侵袭 等，造成细胞急速死亡而结束其生命。
与胞膜融合，形成膜表面的芽状突起，称 为出芽(budding)。
细胞凋亡中细胞膜的变化
• 细胞质的变化：
1. 胞质浓缩：由于胞质脱水而导致细胞皱缩、 致密及固缩(condensation)，是细胞凋亡形 态学变化的一大特征；
2. 细胞器变化：线粒体变大，嵴增多，增殖 并空泡化。内质网腔扩大、增殖并在凋亡 细胞形成自噬体过程中提供包裹膜。其他 多数细胞器完整存在，变得致密。
• 消亡期：凋亡的细胞被邻近的巨噬细胞所吞噬并在 巨噬细胞内降解。
细胞凋亡的分期
凋亡小体的吞噬
• 巨噬细胞上的分子： ABC1 (the class A scavenger receptors); CD36 (the class B scavenger receptors); CD14 (the class B scavenger receptors); αvβ3-integrin (the vitronectin receptor).
HeLa细胞凋亡过程中核染色质的形态学变化
Confocal观察HeLa细胞凋亡过程中的 FITC-Annexin V和PI染色
流式细胞仪检测细胞凋亡
• 在凋亡发生的各个过程当中，都有相应的 流式细胞仪的检测方法，可以采用以下检 测方法： 1、线粒体功能 2、DNA Cycle 3、Caspases 4、Annexin V Assay 5、DNA Fragmentation Assays
细胞凋亡与免疫
细胞凋亡的发现及发展历史
• 1842年，Vogt发现一种不同于细胞坏死的细胞 死亡现象。
• 1887年，Flemming将对这种细胞死亡做了形 态描述。
• 1972年，Kerr首次提出细胞凋亡的概念。
• 1973年，首次在细胞凋亡中发现DNA的降解。
• 今天，细胞凋亡进入分子阶段的研究，近几年已 进入临床应用阶段。
• 线粒体内膜的跨膜电位降低、呼吸链受损、 ATP生成减少、细胞活性氧(ROS)产生增多、 线粒体通透性转换孔(permeability transition pore, PTP)开放和线粒体膜通透性增高，导致 线粒体内的细胞色素C、凋亡诱导因子 (apoptosis inducing factor,AIF)、凋亡蛋白酶 激活因子(apoptotic protease activating factor， Apaf)等凋亡启动因子释放入胞浆。从而诱导 细胞凋亡。
• 凋亡小体形成：
胞膜皱缩内陷，分割包裹胞质，内含DNA物 质及细胞器，形成泡状小体称为凋亡小体 (apoptosis body)，这是凋亡细胞特征性的形 态学改变。凋亡小体呈圆形、椭圆形或不规 则状，小体内的成份主要是胞质、细胞器和 核碎片。
• 吞噬：
凋亡小体形成后，邻近巨噬细胞识别由细胞膜内侧 转移到外侧的磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine, PS)， 并吞噬和消化凋亡小体。整个凋亡过程没有细胞内 容物的外漏，因而不伴有局部的炎症反应。
细胞凋亡与坏死的比较
坏死
性质
病理性
生化特点 被动过程，无新蛋白合成，
不耗能
细胞数量 成群细胞死亡，组织损伤
细胞形状
破裂成碎片
形态变化 细胞肿胀、破坏、细胞结构
全面溶解
染色质 稀疏、分散、呈絮状
DNA电泳 随机降解，电泳呈弥漫条带
炎症反应 溶酶体破裂，局部炎症反应
基因调控
无
潜伏期
无
凋亡 生理性或病理性 主动过程，有新蛋白会成，
耗能 单个细胞丢失 形成凋亡小体 细胞膜及细胞器相对完整， 细胞皱缩，核固缩 致密、固缩、边集或中集 DNA片段化( 80-200bp)， 电泳呈梯状条带 溶酶体相对完整，局部无炎 症反应
有 数小时
细胞凋亡与坏死的形态变化
细胞凋亡的形态学变化
• 细胞膜的变化： 1. 微绒毛、细胞突起和细胞表面皱褶消失； 2. 胞膜迅速发生空泡化，内质网不断扩张并