乳腺癌组织芯片的应用与HER-2neu的表达

收稿日期:2004-03-04

作者简介:官　静(1975-),女,湖北武汉人,硕士研究生,主要从事肿瘤病理的研究。

乳腺癌组织芯片的应用与HER 22/neu 的表达

官　静,刘丽江

(江汉大学医学与生命科学学院病理学与病理生理学教研室,湖北武汉430056)

摘　要　目的:构建乳腺癌及乳腺癌-良性病变组织微阵列,研究HER 22/neu 在原发性乳腺癌和乳腺良性病变中的表达并探讨HER 22/neu 的判断标准。方法:制作乳腺癌-乳腺良性病变组织微阵列(tissue microarray )。用免疫组织化学方法检测HER 22/neu 在180例乳腺癌,32例乳腺良性病变组织中的表达。结果:构建乳腺癌及乳腺癌-乳腺良性病变组织微阵列4个,180例乳腺癌中HER 22/neu 阳性率为37.78%(68/180),32例乳腺良性病变不表达。乳腺癌组织中HER 22/neu 的过表达率显著高于乳腺良性病变组织(P <0.05)。结论:乳腺癌-乳腺良性病变组织微阵列的建立使乳腺癌相关基因及其蛋白产物的筛选工作简便、快捷。HER 22/neu 的过表达与乳腺癌的发生密切相关。

关键词:乳腺癌;组织微阵列;HER 22/neu

中图分类号:R730.2 文献标识码:A 文章编号:100921777(2004)022*******

组织微阵列/组织芯片技术(tissue microarray or tissuechip )是最近伴随基因芯片技术发展起来的一

种新方法,可在一张玻片上一次性完成几百例以上的临床组织标本的基因及其表达的分析,是快速、经济地大规模筛查组织中基因结构改变、表达异常的强有力工具[1]。目前国内用这种技术进行基因表达研究的报道尚不多见。

乳腺癌HER 22/neu 基因的过表达是临床治疗的重要客观依据。石蜡切片HER 22/neu 基因表达的免疫组织化学检测是否能作为治疗的依据,尚有不同的意见。为进一步明确HER 22/neu 基因表达与乳腺癌治疗的相关性,构建了乳腺癌-乳腺良性病变组织微阵列,并结合免疫组织化学法检测了180例乳腺癌及32例乳腺良性病变组织标本中HER 22/neu 基因的表达,在高通量、高标准化分析

的前提下,探讨HER 22/neu 基因表达与乳腺癌的关系及评价的方法。

1　对象与方法

1.1　对象

收集经病理学确诊的乳腺手术标本共265例。其中105例乳腺癌,48例乳腺良性病变标本来自江

汉大学附属医院及其它医院1998～2003年乳腺手术标本,112例乳腺癌标本由北京友谊医院病理科提供。乳腺癌患者年龄31～72岁,平均年龄47.6岁。乳腺良性病变患者年龄16～65岁,平均年龄36.5岁。全部组织标本获取前均未经放疗和/或化

疗。所有组织均经10%缓冲福尔马林固定,石蜡包埋。

1.2　乳腺癌-乳腺良性病变组织微阵列的制作

将蜡块制成5μm 厚HE 染色切片,在低倍镜下用油性笔标出目标区域。并在相应蜡块上做出标记,这些蜡块称为供体蜡块(donor bloke )。制作硬度适中的受体蜡块(35mm ×27mm )。用组织微阵列仪(Microarrayer ,美国B EECHER INSTRU 2M EN TS 公司产品)从265例乳腺手术标本的供体

蜡块中分别提取直径为0.6mm 或2.0mm 的组织芯,插入到受体蜡块中制作成组织微阵列4个。其一为乳腺癌-乳腺良性病变组织微阵列(直径0.6mm ,包括乳腺癌组织样本41例,乳腺良性病变样本48例),其余为乳腺癌组织微阵列,分别包括乳腺癌

组织样本64例(直径0.6mm ,),65例(直径2.0mm )及47例(直径2.0mm )。然后将制成的阵列放

入37℃温箱中20min 使组织与受体蜡块结合紧密。

第32卷　第2期江汉大学学报(自然科学版)

Vol.32　No.2

2004年6月Journal of Jianghan University (Natural Sciences )J un.,2004

常规4μm连续切片。

1.3　HER22/neu免疫组织化学染色

即用型兔抗HER22/neu多克隆抗体(A048529)为美国DA KO公司产品。S2P法即用型检测试剂盒购自福州迈新生物公司。抗原修复方法均为枸橼酸缓冲液(p H=6.0)微波修复10min。染色步骤按试剂盒说明进行。

1.4　HER22/neu结果判定

采用FDA(美国食品和药品管理局)认证Her2 cep Test评分方法[2,3]。未见着色或<10%肿瘤细胞膜着色为阴性,记为(-);>10%的肿瘤细胞膜部分着色为弱阳性,记为(+);>10%的肿瘤细胞膜完全中度着色(棕黄色)为阳性,记为(++);以>10%细胞膜完全重度着色(棕黑色)为强阳性染色,记为(+++)。阳性和强阳性为HER2/neu过表达[4]。所有结果均经两次重复观察,计分不一致者经再次观察予以确认。

1.5　统计学分析

所有数据采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2　结　果

2.1　制成乳腺癌-乳腺良性病变组织微阵列1个,乳腺癌组织微阵列3个。经过4μm连续切片HE 染色以后,乳腺癌标本在载玻片上排列整齐,部分缺失折叠,其余组织点形态良好(图1-3,见封4)。2.2　免疫组织化学染色过程中组织有少量脱落。除去掉片、无肿瘤组织或肿瘤组织不足以分析的病例[5],4个阵列共存乳腺癌样本180例,乳腺良性病变样本32例,组织微阵列的可利用率为80.00%(表1)。其中浸润性导管癌156例,浸润性小叶癌6例,导管内癌10例,髓样癌6例,不典型髓样癌2例,慢性纤维乳腺病22例,纤维腺瘤10例。免疫组织化学染色阳性信号清晰,背景清洁(图4,见封4)。

表1　组织微阵列制作情况

组织芯直径总例数可分析例数利用率(%)

0.6mm895764.04

0.6mm646093.75

2.0mm655584.62

2.0mm474085.11

总计26521280.00

2.3　可供分析的212例乳腺组织标本经两次观察。第一次观察,乳腺癌及乳腺良性病变阳性率分别为37.78%(68/180)、0%(0/32),第二次观察,阳性率分别为36.67%(66/180)、0%(0/32)。经统计学分析,两次观察结果无显著性差异(χ乳腺癌2=0.167, P乳腺癌>0.05;χ良性病变2=0;P良性病变>0.05)。复核两次观察结果,在180例乳腺癌肿瘤组织及32例乳腺良性病变组织中HER22/neu阳性率分别为37.8%(68/180)及0%(表2)。

表2　HER22/neu,ER及PR两次观察结果比较

例数

过表达例数

第一次

观察

第二次

观察

χ2P

乳腺癌18068660.167>0.05

乳腺良性病变32000>0.05

2.4　在180例乳腺癌中,HER22/neu阳性率为37.78%(68/180)。在32例乳腺良性病变中HER2 2/neu无一例出现过表达。乳腺癌组织中HER22/ neu阳性率明显高于乳腺良性病变。两者差异有统计学意义(χ2=17.80,P>0.05)(见表3)。

表3　乳腺癌与乳腺良性病变HER22/neu表达的关系

HER22/neu

总例数

过表达

例数

过表达

率(%)

χ2P

乳腺癌1806837.78

乳腺良性病变320017.80<0.05

3　讨　论

肿瘤的发生发展是多基因、多阶段的发展过程,涉及许多癌基因、抑癌基因及信息传导途径的改变。随着分子生物学的高速发展及基因芯片技术的应用,数以百计新的候补肿瘤基因被发现。但是,却很难将原发改变的基因和继发改变的基因区分开来[1,6]。即在这些改变的基因中哪些是真正的肿瘤基因,哪些是次要的和无关或伴随的基因,基因芯片技术不能解决这些问题。基因芯片筛选出的候补肿瘤基因必须放到大量的实际病例中去检验,并且还需大量体外功能实验和体内实验的验证。需建立一个包含大量肿瘤标本的组织库以便在短时间内进行多种基因及其表达产物的检测,从而明确其与诊断,预后及治疗的关系。用传统方法很难完成这一耗时耗资的检验工作。组织芯片技术为进一步高信息量的筛选、鉴定和验证这些标记基因或片段在临床诊

・

6

・ 江汉大学学报(自然科学版)　总第32卷