鱼粉中霉菌总数及霉菌毒素含量变化的研究

鱼粉中霉菌总数及霉菌毒素含量变化的研究

大综饲料原料如玉米豆粕鱼粉在加工以及运输等过程中会因各种自然环境的影响而使其原有养分

降低和品质的劣化，严重者导致畜禽采食后中毒或死亡[1~3]。影响饲料品质最重要的因素是霉菌的破坏。霉菌大多属于中温型微生物，最适宜生长温度一般为20-30℃，霉菌繁殖产毒的最适温度为25-30℃，湿度达到75％时霉菌才能发芽，在80％-100％的相对湿度时快速生长。而饲料及其原料造成污染的霉菌有150多种，主要是曲霉菌属、青霉菌属、镰刀菌属等菌属。按其生活习性分为仓储性霉菌和田间霉菌[2]在谷物及饲料中常见的产毒素霉菌主要有：曲霉属(Aspergillus)、青霉属(Penicillium)、镰孢菌属(Fusarium)和麦角菌属(Claviceps)等[4~5]。

霉菌毒素是一类天然产生的生物毒素，对人类、动物和植物具有巨大的潜在威胁。随之人类社会的发展，人类对自然资源的开发和利用，真菌毒素产生的危害性越来越大，被人类认识越来越多。它是一种存在于饲料和饲料原料中的抗营养因子。一种霉菌可以产生多种霉菌毒素，而不同的霉菌可以产生同一种霉菌毒素。产毒素菌并非在所有适于生长的温度条件下都能产生毒素。目前研究最多的霉菌毒素有：黄曲霉毒素(aflatoxins)、赭曲霉毒素A(ochratoxin A)、脱氧雪腐镰刀菌烯醇（deoxynivalenol DON）、玉米赤霉烯酮(zearalenone) [3][4] 等。根据真菌毒素作用于人和动物器官部位的不同，将真菌毒素的中毒作用分为肝脏中毒、肾脏中毒、神经中毒、造血组织中毒、光过敏性皮炎中毒及其它中毒等几种。

影响鱼粉霉变的因素主要有温度、湿度和饲料贮存时间，根据要求鱼粉应存放在30℃以下阴凉、干燥、通风处。本文主要目的是模拟鱼粉不同的贮存条件，比较不同贮存条件下鱼粉中霉菌总数及霉菌毒素含量的变化情况。

1 实验材料与方法

1.1实验材料

原料为陕西省西安市某饲料市场上出售的鱼粉。蛋白含量＞55％。

1.2 样品处理与实验方法

1.2.1模拟贮藏条件

鱼粉标准存放时温度要求为＜30℃，而一年四季中15～25℃这个温度范围持续时间较长，所以模拟标准的贮存条件的温度设为20℃±2；而标准存放时湿度要求为低湿的条件，根据资料得知在湿度为65％时鱼粉中大部分霉菌开始生长，但生长很慢，湿度为67％～75％时鱼粉较易发霉，而湿度＞75％时鱼粉迅速发霉，所以模拟鱼粉的贮存条件的湿度设为65％±5、75％±5、85％±5。

1.2.2原料处理

将630g鱼粉样品，分成21份，分别装在培养皿内，置于设定条件下的霉菌培养箱中敞盖充分曝露，定期进行一次检测。

1.2.3霉菌总数的检测：

（1）根据GB/T 13092-2006中饲料中霉菌总数的测定所用的培养基为高盐察氏培养基。

（2 根据GB/T 13092-2006中饲料中霉菌总数的测定所用的检测方法

1.2.4产毒菌种类的检测

(1) 肉眼观察

(2) 根据GB/T4789.16-2003中常见产毒菌的鉴定对菌落进行鉴定

1.2.5毒素检测

利用Beacon毒素检测试剂盒进行鱼粉中毒素含量的检测。

已提供的试剂与材料有：真空包装且包含干燥剂的8×12的微孔板；5瓶浓度分别为0ppb，2.0ppb，4.0ppb，10ppb，25ppb的霉菌毒素标准品；1瓶梅标记物；1瓶底物溶液；1瓶停止液。

1.2.5.1 提取液的制备

甲醇/蒸馏水80/20ml，置于锥形瓶中，震荡摇匀

1.2.5.2 样品制备

粉碎好的样品过20目筛，称取50g样品和5.0g氯化钠至于带塞锥形瓶中，并向其中加入100mL甲醇/水（80:20）提取液，摇匀，静置2-3min时样品沉淀，然后用玻璃纤维滤纸过滤10 mL萃取液，取5mL 萃取液用20mL水稀释，过滤稀释液，待测。

1.2.5.3 检测程序

先将毒素标准品溶液（已提供）及样品液加入测试孔中，然后向测试孔中加入毒素的酶标记物，样品及酶标记物竞争结合连接在微孔上的抗体，10min培养后，倒掉孔中的溶液，洗掉微孔中未的结合霉菌毒素和酶标记物。加入无色的底物溶液，培养10min，所有结合的酶标记物使底物转化成蓝色物质。加入停止液，然后将测试孔放在酶标仪上读取吸光度值，未知浓度样品与标准吸光度值进行比较，就可以得到样品的霉菌毒素的浓度。

2 结果与分析

2.1 霉菌总数的检测

按照1.2.3方法，检测鱼粉中的霉菌并进行计数，其结果如表1所示。

表1 鱼粉不同贮存过程中的霉菌总数(均值cfu/g)

0d 5 d 10d 17d 24 d 31d 38d 65% 20℃ 1.0×103 2.1×103 6.1×103 6.0×1048.1×1059.0×106多不可计

75% 20℃ 1.0×103 2.7×103 6.6×1047.4×105多不可计多不可计多不可计

85% 20℃ 1.0×103 5.4×104 2.1×1059.6×105多不可计多不可计多不可计

注：--- 代表未进行检测；65%、75%、80%指相对湿度

由表1可知，相对湿度65％±5，温度为20℃±2的条件下，在17天内霉菌总数没有超过允许限量，鱼粉营养不会受到霉菌的很大破坏，在第24天时霉菌总数为8.1×105超过了国家饲料卫生标准规定的饲料中霉菌总数的限量标准，1.0×105cfu/g；在相对湿度75％±5，温度为20℃±2的条件下，存放到第17天霉菌总数达到7.4×105 cfu/g；而在相对湿度85％±5，温度为20℃±2的条件下鱼粉存放10天，鱼粉中的霉菌总数就已超标。

2.2 霉菌总数随贮存时间的变化情况

按照1.2.3方法，测定鱼粉中霉菌总数随时间变化情况，其结果如图1所示。

图1 鱼粉中霉菌总数随贮存时间的变化情况

由图1得知，在相对湿度65％±5，温度为20℃±2的条件下，在第24d时霉菌生长旺盛，霉菌总数迅速增加，但增加速度不及其它条件。在中温中湿的条件下，存放到第17d霉菌总数开始迅速增长超过国家标准的霉菌总数限量，而在中温高湿条件下大豆存放10d，开始迅速增长，但贮存17d后在中温中湿条件下鱼粉里的霉菌总数增长速度比中温高湿条件下霉菌总数增长快速。

2.3 产毒菌种类的鉴定

按照1.2.4方法，分析鱼粉中产毒霉菌并进行统计，其结果如表2所示。

表2 产毒菌种类

产毒菌种类

65% 20℃串珠镰刀菌、黄曲霉、赭曲霉、绿青霉、构巢曲霉，在贮存20天后串珠镰刀菌是优势菌

75% 20℃串珠镰刀菌、黄曲霉、赭曲霉、绿青霉、构巢曲霉，在贮存7天后串珠镰刀菌是优势菌

85% 20℃串珠镰刀菌、黄曲霉、赭曲霉、绿青霉、构巢曲霉，在贮存7天后串珠镰刀菌是优势菌由表2可知，主要产毒菌菌属有曲霉属、青霉属和串珠镰刀菌为主。镰刀菌属最适生长温度为20℃。通常谷物在采收前就已感染，在贮藏期间生长旺盛。另外，黄曲霉、构巢曲霉、纯绿青霉也较多。

2.3霉菌毒素含量的检测

表3 霉菌毒素含量（μg/kg）

霉菌毒素0d5d10d17d24d31d38d45d52d

20℃65% 黄曲霉毒素-- -- -- -- 23.2 --- --- --- --- 赭曲霉毒素74.7

呕吐毒素1237 --- --- --- ---

20℃75% 黄曲霉毒素-- -- -- 23.5 --- --- --- --- 赭曲霉毒素75.1

呕吐毒素1824 --- --- --- --- 黄曲霉毒素-- -- 22.4 --- --- --- ---