细胞内AhR信号转导通路的机制研究

细胞内AhR 信号转导通路的机制研究*
庞朋沙
过倩萍
伍会健△
（大连理工大学生命科学与技术学院辽宁大连116024）
摘要：芳香族化合物受体（(Aryl hydrocarbon receptor,AhR ）是一个属于碱性螺旋-环-螺旋（basic helix-loop-helix (bHLH)）Per-Arnt-Sim 同源域(Per-Arnt-Sim homology domain (PAS))家族的转录因子。

在外界环境激素2,3,7,8-四氯-二苯并-对-二恶英（2,3，7，8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin,2,3,7,8-TCDD ）的刺激下，AhR 从细胞质中转运入细胞核中，与另一个蛋白AhR 核转运蛋白(AhR nuclear transportor ，ARNT)结合，形成异二聚体，结合在下游靶基因上，使相应基因，如细胞色素(cytochrome P4501A1/cytochrome P4501B1,CYP1A1/CYP1B1)等异常表达，从而干扰动物的内分泌，引起免疫毒性，甚至导致癌症的发生。

AhR 的激活过程，涉及多种蛋白修饰的变化，如磷酸化、泛素化等，这些修饰调控了蛋白的定位、活性、稳定性等。

AhR 信号转导通路，与其他的很多通路，如E2-ER,MAPK 通路等相互交叉。

本文旨在描述细胞内AhR 通路的激活过程，功能，以及与其他通路之间相互的调控作用，以期为TCDD 引发的相关疾病的预防和治疗提供思路。

关键词：AhR ；TCDD ；磷酸化；泛素化
中图分类号：Q78文献标识码：A 文章编号：1673-6273（2010）
13-2567-04Biological Role of AhR Signaling Pathway*
PANG Peng-Sha,GUO Qian-Ping,WU Hui-Jian △
(School of Life Science and Biotechnology,Dalian University of Technology,Dalian,116024,China)
ABSTRACT:AhR (Aryl hydrocarbon receptor)is a transcription factor belongs to the basic helix-loop-helix (bHLH)Per-Arnt-Sim homology domain (PAS)family.When binds with the ligand 2,3,7,8-TCDD (2,3，
7，8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin),AhR is activated and translocates from cytoplasm to nuclear,forming heterodimer with ARNT (AhR nuclear transportor)and binding to DNA elements and leading to abnormal expression of the target genes such as CYP1A1/CYP1B1(cytochrome P4501A1/cytochrome P4501B1),which finally causes several diseases including cancer.There are several modifications during the activation of AhR,including phosphorylation and ubiquitination and so on,which are related to the localization,activity and stability of proteins.AhR signal pathway also cross-talks with E2-ER and MAPK pathways.This article aims to describe the activation and functions of AhR,and the interactions with other path-ways,hoping to give insights into the prevention and therapy of diseases caused by TCDD.
Key Words:AhR ；TCDD ；Phosphorylation ；Ubiquitination Chinese Library Classification:Q78Document code:A Article ID:1673-6273(2010)13-2567-04
*基金项目：国家自然科学基金(30670409；30771221)，科技部863计划(2006AA02Z120)作者简介：庞朋沙(1987-)，女，硕士研究生，主要研究方向：乳腺癌的发病机制，电话：
+86-411-84709105，E-mail:pangpengsha126@ △通讯作者：伍会健，电话：+86-411-84706105，传真：+86-411-84706105，E-mail:wuhj@ （收稿日期：2010-05-05接受日期：2010-05-31）
前言
二恶英(Dioxin)，是一种无色无味具有强毒性的环境污染物，主要来源于城市和工业垃圾的焚烧。

二恶英由两大类有机化合物组成，分别是多氯二苯并二恶英（polychlorinated diben-zo-p-dioxin ，PCDDs ）和多氯二苯并呋喃（polychlorinated diben-zofuran ，PCDFs ）。

由于脂溶性的性质，二恶英极易在人体内富集，对人类健康造成极大的威胁。

在众多的二恶英当中，以2,3,7,8-四氯-二苯并-对-二恶英（2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin,2,3,7,8-TCDD ，以下简称TCDD)的毒性最强。

其毒性主要表现为：
干扰机体内的分泌，阻遏免疫系统。

此外，TCDD 还有极强的致癌性，可引发软组织癌等在内的多种肿瘤。

根据动物实验与流行病学研究的结果，国际癌症研究机构（IARC ）在1997年的时候将TCDD 确
定为I 类人类致癌物。

在防治二恶英对人体造成毒害的过程中，一方面应该采取措施减少二恶英的产生，另外一方面，为治疗二恶英已造成的疾病，对二恶英引发疾病机制的研究势在必行。

TCDD 对人体的毒害作用主要是由转录因子AhR 介导的。

1AhR 的结构定位与激活过程
AhR 在脊椎动物中存在两个亚型AhR1和AhR2。

AhR1最初在小鼠中被发现，之后被证明在所有的脊椎动物中均有表达，AhR2只在鱼类中表达。

因此，我们通常所研究的AhR 指的是AhR1。

AhR 是一个碱性螺旋-环-螺旋（basic helix-loop-helix (bHLH)）Per-Arnt-Sim 同源域(Per-Arnt-Sim homology domain ，PAS)蛋白，属于bHLH 超家族的转录因子。

AhR 发挥作用时，
需要与另一个bHLH 家族成员ARNT 形成二聚体，才能实现激活的作用。

人源的AhR 由848个氨基酸组成，从N 末端往C 末端分为3个区域(图1)：
bHLH 域、PAS 域和转录激活域（transactivation domain,TAD
）。

bHLH 域又分为碱性域和HLH 域，碱性域主要介导蛋白与DNA 的作用，HLH 域介导AhR 与其他蛋白的二聚化，并决定二聚化蛋白的特异性。

PAS 域包含两个疏水的重复序列A 和B ，作为AhR 与ARNT 二聚化的界面，也影响靶DNA 的构象[1]。

AhR 的TAD 域主要介导AhR 对下游基因的转录激活。

在未与配体结合的情况下，大部分AhR 定位于细胞质中，与热激蛋白90(heat shock protein 90,HSP90)二聚体及乙型肝炎病毒X 蛋白结合蛋白2(hepatitis B virus X protein-associated protein 2,XAP2)结合，形成复合物。

HSP90的结合使AhR 维持在一种非活化的、可与配体结合的状态。

HSP90也与新合成AhR 的起始折叠有关，起稳定AhR 构象及抑制AhR 与ARNT 二聚化的作用。

XAP2一方面改变AhR 被入核蛋白importin β识别的能力，使AhR 锚定在细胞骨架（肌动蛋白丝）上，定位于细胞质中；另一方面抑制AhR 的泛素化降解，从而增强AhR 的转录活性。

AhR 在细胞质中的定位，与自身序列上的核输出信号(nuclear export signal,NES)相关。

AhR 的序列中存在两个NES ，分别位于bHLH 和PAS 域。

配体非结合和结合的AhR 会利用不同的NES ，
前者利用的是PAS 域中的NES ，后者利用的是bHLH 域中的NES 。

AhR 在细胞质中的定位，促进其自身的降解循环，而XAP-2抑制这种泛素化降解，
使AhR 蛋白稳定[2]。

除HSP90和XAP2外，
AhR 复合物中还包括其他的蛋白因子，如p23等，p23增强AhR 与DNA 的结合能力，并促进基因的转录。

AhR 与配体TCDD 结合后，与HSP90解离，转运入细胞核中。

这个过程与AhR N 末端的核输出信号(nuclear localization signal,NLS)相关。

由于该NLS 与bHLH 有部分重叠，所以无配体结合时，被HSP90所掩蔽。

HSP90的解离，使AhR 的NLS 暴露出来，与入核复合物结合，转运入核,再与细胞核中的ARNT 形成二聚体，结合到靶基因的DNA 基序生物异源物质效应元件(xenobiotic-responsive element ，XRE ，也称为DRE )上，启动下游基因的转录（图2）。

关于细胞质中的AhR 如何与细胞核中的ARNT 形成异二聚体，目前存在两种理论。

第一种理论认
为：配体与AhR 结合后，复合物中的其他成分解离出来，游离的AhR 进入细胞核中与ARNT 结合。

第二种理论认为：配体的结合，引起整个AhR 复合物转运到细胞核中。

当AhR 与ARNT 相互作用后，复合物中的其他成分才解离[3]。

而多数人更倾向于前面一种。

ARNT 是一种组成型的细胞核蛋白，也属于bHLH PAS 蛋白家族[2](图1)。

除了与AhR 形成异二聚体外，也可形成同二聚体，或与缺氧诱导因子1a (hypoxia-inducable factor 1a,HIF1a)形成HIF1a/ARNT 异二聚体，参与缺氧所诱导的反应。

由于结构上与HIFa 相似，
ARNT 也被称为HIF β。

AhR 与ARNT 形成的二聚体识别并结合靶基因的XRE ，召募一系列的辅激活因子，如p300/CREB 结合蛋白(p300/CREB-binding protein,p300/CBP),ER 相关蛋白140(ER-associated protein 140,ERAP140),类固醇受体辅激活蛋白11(steroid receptor coactivator-1,SRC-1)，和受体作用蛋白140(receptor-interacting protein 140,RIP140)等[4]，进而调控一系列基因的表达。

这些基因主要包括细胞色素CYP1A1，CYP1A2，CYP1B1，环氧酶2(cyclooxygenase-2，COX-2)。

另外，AhR 阻遏蛋白(AhR repressor,AhRR)也会被AhR 激活表达。

AhRR 在结构上与AhR 相似，都由bHLH 和PAS 域组成，但不具备转录活性。

作为阻遏蛋白，
它一方面与AhR 竞争，同ARNT 形成无活性的异二聚体AhRR-ARNT ；
另一方面，AhRR-ARNT 竞争性地结合到靶基因上，抑制了AhR-ARNT 对基因的转录，从而起到反馈阻遏的作用[5]。

2AhR 的修饰方式
2.1AhR 的磷酸化修饰
AhR NLS 上有3个蛋白激酶C (protein kinase C,PKC)的磷酸化基序：S12、T22、S36。

其中S12和S36的磷酸化，对AhR 的入核起负调控作用，并且影响AhR 与DNA 的结合能力。

NES 附近残基的磷酸化，可调节AhR 在细胞中的定位。

丝裂原活化的蛋白激酶p38(p38mitogen-activated protein kinases ，p38)对AhR NES 中S68的磷酸化，就可使AhR
从细胞质向细
图1人源AhR 和ARNT 的结构图Fig 1The structure of human AhR and ARNT
图2TCDD 对于AhR 的激活过程Fig 2The activation of AhR by TCDD
胞核中转运。

AhR入核之后，S36又重新被磷酸化，增强的AhR/ARNT/XRE活性，促进基因的转录[6]。

AhR的磷酸化不仅与上游的激酶相关，也受到自身氨基酸的影响。

研究表明，AhR的Y9，虽然不是磷酸化残基，但是对于DNA结合是必需的。

如果将其突变为F，会削弱AhR对XRE 的结合，降低AhR对靶基因的转录。

这可能是因为Y9在PKC 对S/T的识别中具有重要的作用，促进PKC对AhR的磷酸化，从而在AhR的活性调节上具有关键作用。

2.2AhR的泛素化修饰
活化的AhR诱导靶基因转录后，很快进入降解阶段。

在体外，小鼠肝细胞和hepatama细胞中，位于细胞质的AhR可由Ca2+依赖的方式、经calpain II-like蛋白酶降解。

完整的细胞中，TCDD诱导的AhR降解是由26S蛋白酶体介导的，使AhR 的半衰期由28h降至3h，对活化的AhR起负调控的作用。

而TCDD不影响ARNT的稳定性。

AhR的泛素化位点位于TAD域。

泛素化降解部分依赖于AhR/ARNT异二聚体的形成，以及该异二聚体与DNA的结合[7]。

除了作为泛素化的靶蛋白之外，AhR在介导其他蛋白的泛素化过程中也起着重要的作用。

研究表明，当AhR被3-甲基胆蒽(3-Methylcholanthrene，3-MC)或TCDD激活后，使雌激素受体a（estrogen receptor a,ERa）、ERβ、雄激素受体（androgen recep-tor，AR）的蛋白水平剧烈下降，负调控性激素信号通路[8]。

3-MC刺激后，细胞内可形成CUL4B-AhR复合物，该复合物由受损DNA结合蛋白1（damaged-DNA-binding protein1, DDB1），AhR，ARNT，转导素-β样蛋白3(transducin-β-like3, TBL3)，滞蛋白(cullin4B，CUL4B，泛素连接酶的核心成分)和环结构蛋白1(RING-box protein1，Rbx1)组成。

活化的AhR作为具有底物特异性的接头蛋白，将ERa、AR等募集到复合物中，起泛素E3连接酶的作用，促进这些性激素受体的泛素化降解[9]。

3AhR通路与其他通路的交叉
3.1AhR通路与E2-ER通路的交叉
ARNT可作为ERα和ERβ依赖的转录辅激活因子。

这种辅激活的作用主要是通过ARNT与ER的直接作用介导的，并且依赖于ER配体结合域。

通过这种作用，ARNT被募集到ER的靶基因上，起到辅激活的作用。

但是只有当E2存在时，ARNT才具有较强的增强转录的作用。

以TCDD与E2共刺激时，ERα促进AhR下游靶基因的转录。

这是因为ERα被募集到AhR的复合物中，促进AhR的转录活性。

与之相应，ERα与自身靶基因的结合减弱。

有研究表明，E2可增强ERα和Sp1的相互作用，引起酰基甲酰磷酸合成酶/天冬氨酸转酰基甲酰转移酶/氨甲酰天冬氨酸脱水酶（carbamyl phosphate synthetase,aspartate transcarbamylase and dihydroorotase,CAD）基因的表达。

被TCDD活化的AhR，抑制了ERα-Sp1的相互作用，并将ERα募集到AhR应答基因的启动子上，抑制CAD基因的表达[10]。

3.2AhR通路与与MAPK通路的交叉
丝裂原活化的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAPK)通路主要包括胞外信号调节激酶(extracellular sig-nal-regulated kinase1/2,ERK1/2)，p38和c-Jun N端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)信号通路。

TCDD可同时激活这3个通路。

一方面，ERK活性增强AhR配体起始的转录活性，另一方面，ERK对AhR C末端的磷酸化，促进AhR的泛素化降解[11]。

p38参与调节AhR的细胞内定位，如对AhR NES中S68的磷酸化促使蛋白由细胞质转运入核。

但p38MAPK信号通路并不参与TCDD对CYP1A1mRNA的诱导。

研究表明，往Hepa-1细胞中转入MKK3/6无活性突变体,并不会影响TCDD 对CYP1A1报告基因的诱导作用。

转入p38无活性的突变体p38DN与转入p38产生的效果也是一样的。

虽然p38的抑制剂，如SB203580、SB202190或SB202474，不论能否抑制p38的活性，均可以阻遏TCDD对小鼠Hepa-1和人Hepa-2细胞的CYP1A1-mRNA以及人MCF-7的CYP1B1-mRNA的诱导作用。

但这些抑制剂对于CYP1A1基因转录的阻遏作用不是由于对p38酶活性的抑制引起的，而是因为它们可阻遏一些具有组蛋白乙酰化转移酶活性的辅激活子的募集，而这些因子对CYP1A1-mRNA的转录是必需的[12]。

尽管采用MAPK各成员的抑制剂，都可抑制活化的AhR 对CYP1A1的诱导，但是MAPK通路参与AhR通路的具体机理尚不清楚，因为这些通路的抑制剂，也多少能够抑制配体到AhR的结合，也就无法确定是否是MAPK的酶活性参与到了AhR信号通路中。

4AhR的功能
4.1干扰内分泌
AhR与性激素通路相互交叉，一方面，被TCDD活化的AhR将性激素受体ER和AR募集到CUL4B-AhR复合物中，起泛素E3连接酶的作用，促进这些受体的降解。

另一方面，通过相互作用，活化的AhR将激素受体召募至自身的靶基因上，从而使ER和AR对于雌激素和雄激素的应答减弱。

在雌性动物中引发卵巢功能障碍、不孕、胎仔减少、流产，在雄性动物中引发精细胞减少、成熟精子退化、雌性化。

4.2阻遏免疫系统
在实验室的啮齿动物模型中，不论是快速或慢性地接触低剂量的TCDD，都会阻遏动物中体液或细胞免疫。

另外，TCDD 也能够增加动物对一些感染性疾病的易感性，削弱对移植肿瘤的排斥，并且加快肿瘤的生长及转移，这些作用都是通过对免疫系统的改变造成的。

TCDD的免疫毒性可能通过非淋巴组织诱导，并且这种诱导作用不是直接的。

其可能的机制为：1，TCDD通过AhR影响内分泌系统，而该系统能够产生调节免疫系统的激素；2, TCDD的这种免疫阻遏作用的关键的、AhR依赖的目标是由骨髓细胞衍生的淋巴或骨髓细胞。

4.3致癌
苯并芘(Benzo[a]pyrene,B[a]P),是环境中的污染物之一，可结合到AhR上，在多种动物种类中引发皮肤癌等癌症。

研究表明，AhR下游的基因产物CYP可以将B[a]P分解成为具有基因毒性的产物，从而诱发癌症。

另外，紫外线UV也与癌症的引发相关，其照射色氨酸所产生的光电子产物，对于AhR具有很高的亲和力，被看作是
AhR的内源性配体。

UVB部分(280-315nm)对于皮肤癌的引发具有相当高的效率。

在小鼠的皮肤和人角化细胞中发现，UVB 照射后，产生AhR的配体，将AhR活化后，激活CYP1A1的表达，促进EGFR的内在化，随后诱导COX-2的表达[13]。

其中，CYP1A1诱导产生具有DNA毒性的致癌物，导致肿瘤细胞的产生。

COX-2抑制细胞的凋亡，使肿瘤细胞发展成为可检测的皮肤癌[14]。

4.4调节细胞节律
在小鼠的肝、肺和胸腺细胞中，AhR的表达呈周期性。

在无外源刺激的条件下，AhR对周期节律没有影响。

当AhR被TCDD激活后，可打破与小鼠造血前体相关的周期节律，破坏LSK骨髓细胞静息的周期节律，破坏LSK细胞中period基因1/2（period gene1/2,Per1/2）表达的周期性。

反之，Per1/2基因的破坏，会改变AhR的信号通路。

在Per1/2基因破坏的小鼠中，TCDD所诱导的CYP1A1和CYP1B1的表达水平也比正常的小鼠更高。

大量的研究表明，TCDD活化的AhR对节律的作用，可能是通过影响经典的昼夜节律运动输出周期故障（Circadian Lo-comotor Output Cycles Kaput,CLOCK）基因而发生的。

TCDD 的使用，改变了CLOCK及CLOCK控制的基因的表达水平，导致周期节律的消失，从而无法适应外界环境的改变[15]。

5结语
二恶英是环境中普遍存在的污染物，由于脂溶性的特质，易于在生物体内富集。

生物链的传递作用，使二恶英对于人体的危害更为明显。

一方面，二恶英干扰机体内的分泌，抑制性激素的作用，使雌性动物卵巢功能障碍、不孕、胎仔减少、流产，使雄性动物精细胞减少、成熟精子退化、雌性化；另一方面，二恶英具有极强的免疫毒性，引起动物胸腺萎缩、免疫功能降低等。

并且二恶英对于动物有极强的致癌性，可引发软组织癌等在内的多种肿瘤。

因此，二恶英的发病机制，是目前世界上的研究热点之一。

二恶英的作用，是由芳香烃受体AhR介导的。

作为转录因子，AhR的活性受到多方面的调控，如磷酸化、泛素化等，这些修饰影响AhR在细胞中的定位、转录活性以及稳定性。

并且这些作用也与其他通路相互交叉。

如AhR的激活，引起ER、AR 等的降解，对性激素受体的抑制，导致二恶英对人体内分泌的干扰。

MAPK作为磷酸化激酶，对AhR的磷酸化状态起到重要的调控作用，但是具体的机制还有待于进一步的研究。

而AhR 与ARNT形成二聚体后，激活的表达产物，如细胞色素等，可将环境中的一些多环芳烃类化合物降解为对DNA有毒害作用的产物，这可能是引发癌症的重要原因。

尽管目前不知道二恶英究竟以何种方式对免疫系统进行削弱，但相信这种免疫毒性可以加快人体病变。

另外，AhR也对时钟基因CLOCK、Per1/2等产生影响，最终对细胞的节律产生影响，但是相关的机制也并不是十分的清楚。

因此，这些机制的研究，对治疗由二恶英引发的疾病具有重大的意义。

参考文献(References)
[1]Kikuchi Y,Ohsawa S,Mimura J,et al.Heterodimers of bHLH-PAS
protein fragments derived from AhR,AhRR,and Arnt prepared by co-expression in Escherichia coli:characterization of their DNA bind-ing activity and preparation of a DNA complex[J].J Biochem.2003, 134(1):83-90
[2]Berg P,Pongratz I.Differential Usage of Nuclear Export Sequences
Regulates Intracellular Localization of the Dioxin(Aryl Hydrocarbon) Receptor[J].J Biol Chem.2001,276(46):43231-8
[3]Petrulis JR,Perdew GH.The role of chaperone proteins in the aryl hy-
drocarbon receptor core complex[J].Chem Biol Interact.2002,141 (1-2):25-40
[4]Kumar MB,Ramadoss P,Reen RK,et al.The Q-rich subdomain of the
human Ah receptor transactivation domain is required for dioxin-me-diated transcriptional activity[J].J Biol Chem.2001,276(45): 42302-10
[5]Oshima M,Mimura J,Sekine H,et al.SUMO Modification Regulates
the Transcriptional Repressor Function of Aryl Hydrocarbon Receptor Repressor[J],J Biol Chem.2009,284,11017-11026
[6]Ikuta T,Kobayashi Y,Kawajiri K.Phosphorylation of nuclear local-
ization signal inhibits the ligand-dependent nuclear import of aryl hy-drocarbon receptor[J].Biochem Biophys Res Commun.2004,317(2): 545-50
[7]Ma Q,Baldwin KT.2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin-induced
degradation of Aryl hydrocarbon receptor(AhR)by the ubiquitin-pro-teasome pathway[J].J Biol Chem.2000,275,8432-8438
[8]李淑晶,刘文栋,伍会健.二恶英雌激素受体的干扰作用[J].生命科
学,2008,20(5):764-7
Li SJ,Liu WD,Wu HJ.Interference of estrogen receptor by dioxin[J].
Chinese Bulletin of Life Sciences,2008,20(5):764-7(In Chinese) [9]Ohtake F,Baba A,Takada I,et al.Dioxin receptor is a ligand-depen-
dent E3ubiquitin ligase[J].Nature.2007,446(7135):562-6
[10]Khan S,Barhoumi R,Burghardt R,et al.Molecular Mechanism of In-
hibitory Aryl Hydrocarbon Receptor-Estrogen Receptor/Sp1Cross Talk in Breast Cancer Cells[J].Mol Endocrinol.2006,20(9): 2199-214
[11]Chen S,Opera觡a T,Bonzo J,et al.ERK kinase inhibition stabilizes
the Aryl hydrocarbon receptor[J].J Biol Chem.2005,280(6):4350-9.
[12]Shibazaki M,Takeuchi T,Ahmed S,et al.Suppression by p38MAP
Kinase Inhibitors(Pyridinyl Imidazole Compounds)of Ah Receptor Target Gene Activation by2,3,7,8-Tetrachlorodibenzo-p-dioxin and the Possible Mechanism[J].J Biol Chem.2004,279(5):3869-76. [13]Nair S,Kekatpure VD,Judson BL,et al.UVR exposure sensitizes
keratinocytes to DNA adduct formation[J].Cancer Prev Res(Phila Pa).2009,2(10):895-902
[14]Park JH,Mangal D,Frey AJ,et al.The aryl-hydrocarbon receptor
(AhR)-facilitates DNA strand breaks and8-oxo-2'-deoxyguanosine formation by the aldo-keto reductase product benzo[a]pyrene-7, 8-dione[J].J Biol Chem.2009,284,29725-29734
[15]Shimba S,Watabe Y.Crosstalk between the AhR signaling pathway
and circadian rhythm[J].Biochem Pharmacol.2009,77(4):560-5。