出芽短梗霉发酵生产普鲁兰多糖研究进展

收 稿 日 期 ：２０１１－１２－０３ 基 金 项 目 ：陕 百度文库 省 科 学 院 科 技 计 划 重 点 项 目 （２０１０Ｋ－０２）。 作 者 简 介 ：安 超 （１９８５－），男 ，陕 西 西 安 人 ，西 北 农 林 科 技 大 学 本 科 ，研 究 方 向 ：微 生 物 功 能 代 谢 产 物 的 发 酵 。
Ｋｕｍａｒ研究发现，培养基中 Ｃ／Ｎ 为１０∶１是 发酵生产普 鲁 兰 多 糖 最 合 理 的 条 件。 此 外，培 养 基中其他无机离子的浓度也需要根据碳氮浓度的 不同调 节［１６］，Ｃｈｅｎｇ优 化 了 包 括 蔗 糖，酵 母 膏，磷 酸 氢 二 钾 三 个 实 验 因 素 ，最 终 ，优 化 培 养 基 中 包 含 ７５．０ｇ／ｌ蔗 糖 ，３．０ｇ／ｌ酵 母 膏 ，５．０ｇ／ｌ Ｋ２ＨＰＯ４， 普 鲁 兰 多 糖 的 产 量 达 到２５．８ｇ／ｌ，纯 度 为９４．５％ 。 ２．２ ｐＨ 和温度对普鲁兰多糖发酵的影响
大多数微生物产生胞外多糖的功能与其自我 保护机制相关，微 生 物 用 分 泌 的 大 分 子 多 糖 包 裹 自 身 形 成 一 层 保 护 膜，防 止 自 身 干 燥 或 者 被 侵 染 。 ［５］ 国内外虽然对出芽短梗霉的细胞学及 生 理 学特征进行了大 量 的 研 究，但 短 梗 霉 多 糖 的 生 物 合 成 机 理 目 前 仍 然 存 在 争 议 。Ｄｕａｎ 在 ２００８ 年 提 出了一种可能的普 鲁 兰 多 糖 生 物 合 成 途 径 （见 图 １）［６］。在无细胞的出芽短 梗 霉 酶 系 中，加 入 ＡＴＰ 和 ＵＤＰＧ（尿甘二磷酸 葡 萄 糖）时，短 梗 霉 多 糖 可 以得到合成，而 且 ＵＤＰＧ 不 能 被 ＡＤＰＧ（腺 苷 二 磷 酸 葡 萄 糖 ）取 代 ，表 明 短 梗 霉 多 糖 链 或 短 梗 霉 多 糖前 体 起 源 于 ＵＤＰＧ，可 以 证 明，作 为 葡 萄 糖 和 淀粉合成主 要 途 径 的 ＡＤＰＧ 的 转 糖 苷 过 程 并 没 有在 短 梗 霉 多 糖 合 成 中 发 生。Ｃａｔｌｅｙ 和 Ｍｃ－ Ｄｏｗｅｌｌ提出 了 短 梗 霉 多 糖 形 成 的 反 应 进 程。 最 初 阶 段 是 ＵＤＰＧ 脱 下 葡 萄 糖 残 基 和 脂 质 分 子 （ＬｐＨ）通过磷酸酯键结合，然后另一个 ＵＤＰＧ 的 葡萄糖残基通过 转 移 反 应，形 成 与 脂 质 体 连 接 的 异 麦 芽 糖 基 （Ｉｓｏｍａｌｔｏｓｙｌ）［７］。
温度是影响普鲁兰多糖生成的一个重要影响 因素。不同来 源 菌 株 及 不 同 发 酵 条 件 下，最 适 温 度范围在 ２５℃ －３０℃。 然 而，对 于 相 同 菌 株，不 同的研究团队获得不同 的 最 适 温 度。 Ｗｕ 等 人 在 ２０１０年报道了 双 阶 段 温 度 控 制 发 酵 生 产 普 鲁 兰 多糖［２０］，结果证明，温 度 ２６℃ 有 利 于 普 鲁 兰 多 糖 的生成，而温 度 在 ３２℃ 时，有 利 于 菌 体 的 快 速 生 长。此外，在他们 的 研 究 中 还 发 现 发 酵 过 程 中 温 度会影响细胞形态，２６℃ 有利于发酵液酵母状单 细胞的生长。 ２．３ 通 气 量 对 普 鲁 兰 多 糖 发 酵 的 影 响
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陕 西 农 业 科 学
２０１２（３）
１：α－ 磷 酸 葡 萄 糖 异 构 酶 ；２：尿 苷 二 磷 酸 焦 磷 酸 化 酶 ；３ 葡 糖 基 转 移 酶
图 １ 普 鲁 兰 多 糖 生 物 合 成 途 径 推 测
２ 普鲁兰多糖发酵条件优化
作为氮 源。Ｃａｍｐｂｅｌｌ报 道 ＮＨ４＋ 可 能 影 响 普 鲁 兰多糖产生酶的活性并且控制碳源进入细胞的过
ｐＨ 和最优的多糖生 成 ｐＨ 是 不 相 同 的。Ｌａｃｒｏｉｘ 在１９８５年也提出了两个阶段 ｐＨ 控制模式，就是 先在 低 的 ｐＨ２．０ 条 件 下 大 量 生 成 菌 体，然 后 将
方式或是通过筛 选 菌 株，优 化 培 养 条 件 等 方 式 克 ｐＨ 调到５．０促进 普 鲁 兰 多 糖 的 生 成。 通 过 这 样 服。Ｃｈｅｎｇ在发酵 中 优 化 了 碳 源 和 氮 源 的 浓 度， 的发 酵，普 鲁 兰 多 糖 的 产 量 从 １７ｇ／ｌ提 高 到 ２６
普鲁兰多 糖 是 无 色、无 味、无 臭 的 高 分 子 物 质 ，呈 粉 末 状 ，溶 于 水 时 散 发 出 微 微 的 甜 味 。 它 含 有 丰 富 的 羟 基 ，极 易 溶 于 水 ，不 溶 于 油 脂 、醇 类 、丙 酮、醚和氯仿 等 有 机 溶 剂。 除 此 外 它 还 具 有 以 下 的特性：无 毒 安 全 性、耐 热 性、耐 盐 性、耐 酸 碱 性、 粘结性、可塑 性、易 分 解、薄 膜 性 质 等。 正 是 由 于 普鲁兰多糖具有 以 上 的 性 质，使 得 它 能 应 用 于 食 品、医药、日用化工、建材、环保等众多领域 。 ［４］
获得的葡萄糖碳源可能需要三个酶的作用，最 终会转变成普鲁兰多糖，这三个酶是 α－磷酸葡萄 糖异构酶，尿甘二磷酸焦磷酸化酶，葡糖基转移酶。 除了葡萄糖，出芽短梗霉也能够以蔗糖，甘露糖，半 乳糖，果糖 甚 至 工 农 业 废 弃 物 作 为 碳 源［８］。因 此， 己糖激酶和异构酶可能参与了将不同的碳源转变 成普鲁兰多糖的前体物－尿苷二磷酸。
许多研究已经 证 明，出 芽 短 梗 霉 能 够 利 用 各 种 物 质 ，即 使 是 工 农 业 废 弃 物 ，出 芽 短 梗 霉 也 能 够 利用其复杂的酶系统将其转化成普鲁兰多糖。以 下是近几年人们对出芽短梗霉培养基及培养条件 优化的最新研究成果。 ２．１ 碳 源 和 氮 源 对 普 鲁 兰 多 糖 发 酵 的 影 响 蔗糖已经被证明是发酵生产普鲁兰多糖最理 想碳源 。 ［９］ 相对 葡 萄 糖，蔗 糖 作 碳 源 能 够 获 得 更 高的普鲁 兰 多 糖 产 率 和 纯 度 。 ［１０］ 木 糖 和 乳 糖 作 为碳 源，菌 体 和 普 鲁 兰 多 糖 的 生 产 活 性 都 很 低 。 ［６，１０］ 近几年 来，一 些 农 业 和 食 品 业 废 弃 物 如 甜菜 渣，土 豆 水 解 液，甘 蔗 汁，红 薯 等 也 被 证 明 能 够高效地合成普鲁兰多糖 。 ［１１］
普鲁兰多糖（ｐｕｌｌｕｌａｎ）是 由 出 芽 短 梗 霉 （Ａｕ－ ｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ ｐｕｌｌｕｌａｎｓ）在 生 长 过 程 中 以 蔗 糖 或 可溶性淀粉 等 多 种 物 质 为 碳 源 转 化 而 来。Ｂａｕｅｒ 在１９３８年首次报 道，但 化 学 组 成 不 详［１］。Ｂｅｎｉｅｒ 在 １９５９ 年 也 发 现 了 这 种 粘 性 物 质 ，并 证 明 为 右 旋 葡萄糖苷聚合物，定 名 为 普 鲁 兰 多 糖 。 ［２］ Ｗａｌｌｅｎ－ ｆｅｌｓ等 人 在 Ｂｅｎｄｅｒ发 现 的 基 础 上 确 认 该 多 糖 是 一种由２个α－１，４－糖苷键连接的麦芽三糖经 α －１，６－糖苷 键 聚 合 而 成 的 直 链 多 糖。 普 鲁 兰 多 糖为无定型 多 糖，分 子 量 大 小 取 决 于 聚 合 度 ＤＰ （Ｄｅｇｒｅｅ ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ），ＤＰ 受 菌 株 类 型、培 养时间、碳源 种 类 与 浓 度 等 因 子 制 约。 普 鲁 兰 多 糖平均分子质量大小及普鲁兰多糖的分子质量分 布决定普鲁兰多糖生物学活性及免疫调节活 性 。 ［３］
培养基中碳源浓度高 于 ５％ 会 抑 制 普 鲁 兰 多 糖的生产 。 ［１２］ 可 能 是 由 于 高 浓 度 碳 源 抑 制 了 与
程 。 ［１４］ 以 ＮＨ４＋ 作 氮 源 时，菌 体 的 累 计 与 普 鲁 兰 产率属于氮 源 限 制 性 过 程，即 增 加 ＮＨ４＋ 的 浓 度 可 强 化 碳 源 更 多 地 形 成 菌 体 ，增 加 菌 体 总 重 量 ，但 同时降低了普鲁兰的产率 。 ［１５］
目前，普鲁兰 多 糖 的 研 究 主 要 集 中 在 高 产 、低 色素优良菌株的选育，普鲁兰多糖生物合成机理探 究 ，培 养 条 件 的 优 化 等 方 面 。 这 篇 综 述 主 要 阐 述 了 普鲁兰多糖生物合成机理及近年来通过培养参数 优化提高普鲁兰多糖产量的最新研究进展。
１ 普鲁兰多糖的生物合成机理
通气量是细胞 生 长 的 重 要 影 响 参 数，在 一 个 厌氧的环境中，细 胞 既 不 会 生 长 也 不 会 产 生 普 鲁 兰多 糖。Ｒｏｕｋａｓ ａｎｄ Ｍａｎｔｚｏｕｉｄｏｕ 研 究 表 明，高 于２个ｖｖｍ（１个ｖｖｍ 被定义为１ｌ发酵液中在每 分钟内通气量为 １ｌ）时，普 鲁 兰 多 糖 和 菌 体 的 产 量 都 有 比 较 大 的 提 高 ，但 是 ，生 成 的 普 鲁 兰 多 糖 分 子质量偏小，实用价值不高，可 能 是 因 为 α－ 淀 粉 酶的活 性 被 改 变。 Ｗｅｃｋｅｒ在 ２００５ 报 道，普 鲁 兰 多糖的产量在低 的 搅 拌 转 速 下 有 很 大 提 高，尽 管 低的搅拌转速导 致 了 溶 氧 的 下 降，得 到 的 可 能 结 论 是 ，出 芽 短 梗 霉 在 低 的 搅 拌 剪 切 力 的 作 用 下 ，大 多数细胞呈酵母状 。 ［２１］ 另 外 一 种 假 设 是，由 于 发 酵 液 具 有 高 的 粘 度 ，高 通 气 量 导 致 泡 沫 的 产 生 ，不 利 于 产 生 发 酵 的 进 行 。Ｃｈｅｎｇ 在 ２０１１ 报 道 ，当 通 气量为１．５ｖｖｍ 时，具 有 更 高 的 普 鲁 兰 多 糖 产 量 和 产 率 ，最 终 产 生 ２５．８ｇ／ｌ普 鲁 兰 多 糖 。 ２．４ 光 照 强 度 对 普 鲁 兰 多 糖 发 酵 的 影 响
安 超 等 ：出 芽 短 梗 霉 发 酵 生 产 普 鲁 兰 多 糖 研 究 进 展
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细 胞 与 菌 丝 的 比 例，这 是 一 个 已 经 证 明 的 事 实。 当 ｐＨ 低于２－２．５ 时，菌 体 几 乎 完 全 呈 菌 丝 状， 酵母型细胞极少；在初始 ｐＨ３－５．５的范围内，菌 体总重量达到最大值；在 ｐＨ６－７的范围内，培养 基中菌体形态以 酵 母 型 细 胞 为 主，约 可 占 细 胞 总 量的 ８０％ －９０％。 酵 母 型 细 胞 在 中 性 ｐＨ 的 环 境中，可以 生 成 高 分 子 量 的 普 鲁 兰 多 糖 （ＭＷ ＞ ２ ０００ ０００）［１８］，菌丝 型 和 酵 母 型 细 胞 共 培 养 能 够 得到高的普鲁兰多糖产量 。 ［１９］
最终，在蔗糖初始 浓 度 为 １００ｇ／ｌ的 条 件 下，普 鲁 兰 多 糖 的 产 量 达 到 ６０．７ｇ／ｌ［１３］。
ｇ／ｌ［１７］。 虽然细胞形态影响普鲁兰多糖生成的结论仍
在普鲁 兰 多 糖 的 发 酵 中，一 般 都 使 用 ＮＨ４＋ 然有争议，但是，ｐＨ 的 变 化 制 约 培 养 基 中 酵 母 型
大量的实验证明 普 鲁 兰 多 糖 发 酵 最 优 的 ｐＨ 在５．５－７．５ 之 间。Ｃａｔｌｅｙ 在 １９７１ 年 就 提 出 ｐＨ 对 普 鲁 兰 合 成 的 影 响 ，结 果 表 明 ，最 优 的 菌 体 生 成
普鲁兰多糖合 成 相 关 的 酶 的 活 性，如 α－ 磷 酸 葡 萄 糖 异 构 酶 ，尿 苷 二 磷 酸 焦 磷 酸 化 酶 ，葡 糖 基 转 移 酶 。 ［６］ 这种抑制可以通过补料发酵和连续发 酵 的
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·综 述·
陕 西 农 业 科 学
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出芽短梗霉发酵生产普鲁兰多糖研究进展
安 超 ，常 帆 ，马 赛 箭 ，薛 文 娇 （陕西省微生物研究所 微生物代谢产物研究中心，陕西 西安 ７１００４３）
摘 要：普鲁兰多糖是通过多形态真菌出芽短梗霉（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ ｐｕｌｌｕｌａｎｓ）发 酵 获 得 的 一 种 线 性 高 分 子 聚 合物，是通过麦芽三糖以 α－１，６－糖苷键连接而 成。 普 鲁 兰 多 糖 在 从 食 品 添 加 剂 到 环 境 修 复 等 各 个 领 域 得 到广泛的应用。这篇综述概述了普鲁兰多糖的生物合成途径和近年来通过培养参数优化提高普鲁兰多糖产 量的最新研究进展。 关 键 词 ：出 芽 短 梗 霉 ；普 鲁 兰 多 糖 ；生 物 合 成 ；培 养 优 化