蛋白结构解析流程概要

结构解析和修正流程
以下是我总结的晶体结构解析方法：
I 分子置换法
使用condition：目标蛋白A有同源蛋白结构B，同源性30%以上。

用到的软件及程序： HKL2000, CCP4, COOT, Phenix, CNS,
解析过程：收集数据（X-RAY）--> hkl2000 处理数据--> 置换前数据处理分子置换（ccp4 Molecular Replacement--MR） -->COOT手工修正，氨基酸序列调换 -->phenix refine--coot 手工修正 phenix refine。

__拉氏构象图上outlier为0为之，且R-free，R-work达到足够低的值。

-->phenix 加水refine （溶剂平滑）。

（若修正过程中有bias 最好也用CNS修正一下）II 同晶置换法--硒代蛋白
使用condition：目标蛋白没有同源结构。

用到的软件及程序：HKL2000, CCP4, COOT, Phenix, CNS,
解析过程：收集数据（X-ray 硒代蛋白及母体蛋白）--> hkl2000处理数据-->ccp4 程序包搜索搜索硒信号（gap），相位确定 -->搭模 --->以硒代数据得到的pdb为模型和母体高分辨数据得到的mtz进行分子置换--> 后面修正过程与分子置换相似。

各步骤介绍：
I .hkl2000：将x-ray 收集的图像编译转化为数字信息，得到的关键文件有.sca和.log ，log文件会给出hkl2000 处理的过程记录，sca文件是最终处理的输出文件。

sca文件包含晶体的空间群等信息。

带有可以被转化为电子密度图的信息。

评价hkl2000处理是否成功的参数有数据完整度，最高分辨率等，一般希望处理出在完整度允许的情况下最高分辨率的数据。

分子置换前处理：ccp4 软件包
a. data reduction，即将sca文件转换为mtz文件。

用imported integrated data。

b. cell content analysis 这个是晶体中蛋白聚集体数的分析，通过分析晶体含水量得到一个晶胞内的蛋白分子数。

用mtz文件进行。

含水量在40%-60%之间时对应得n即为正确值。

这个聚集体数会在mr中使用。

II. model 选取：进行分子置换的model为已知的同源蛋白结构或硒代得到的pdb，对model的要求是越接近球形越好。

一般用单体。

从pdb库中下载了pdb后可以用vim编辑，选取自己想要的那一段做model。

III. 分子置换：ccp4 软件包
MR 以选取好的model.pdb为模板，对mtz文件进行分子置换，这时要修改的程序参数为在晶体中寻找的model的个数，及分子量，model的个数通过
N值来计算，如果model为单体的话，model个数即为n值。

MR之后会得到
一个pdb，一个mtz（电子密度图）。

IV.修正：
COOT 修正：在coot中同时打开pdb和mtz，手工用命令将pdb残基突变为自己氨基酸的序列，并将氨基酸残基放入密度中。

phenix 修正：命令 phenix.refine protein.sca protein.pdb
修正完成后会得到一个protein—refine.pdb, 一个 protein_refine.coeff.mtz, 一个data.mtz。

其中pdb文件即为目标pdb，coeff.mtz为相应的电子密度
图，data.mtz在第二轮coot手工修正后再phenix的时候代替sca的位置。

phenix加水溶剂平滑修正
对于结构质量的评价标准：
拉氏构象图：outlier的数量要为0~（ coot中看到）
R-work 和R-free 的值，越低越好~（这个参数可以在phenix之后的.sol
文件中看到）
总结：HKL2000-->.sca-->data reduction-->.mtz--> cell content analysis(n)-->MR--> .pdb, .mtz-->coot mutation--> phenix1（--pick out good chain-->MR2 --> phenix2 ）--> coot--
>phenix......(CNS)...... phenix+water.....
*（）中是我根据自己的修正加上去的，仅供参考
硒代相位的确定以后再补吧~ 太长了。