各种酶切位点的保护碱基

各种酶切位点的保护碱基

酶不同，所需要的酶切位点的保护碱基的数量也不同。一般情况下，在酶切位点以外多出3个碱基即可满足几乎所有限制酶的酶切要求。在资料上查不到的，我们一般都随便加3个碱基做保护。

寡核苷酸近末端位点的酶切

（Cleavage Close to the End of DNA Fragments

（oligonucleotides）

为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求，NEB采用了一系列含识别序列的

短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。实验结果对于确定双酶切顺序将会有帮助（比如在多接头上切割位点很接近时），或者当切割位点靠近DNA末端时也很有用。在本表中没有列出的酶，则通

常需在识别位点两端至少加上6个保护碱基，以确保酶切反应的进行。

实验方法：用Y[32P]ATP在T4多聚核苷酸激酶的作用下标记0.1A 260单位的寡核苷酸。取1 Q

已标记了的寡核苷酸与20单位的内切酶，在20° C条件下分别反应2小时和20小时。反应缓冲液含70 mM Tris-HCI （pH 7.6）, 10 mM MgCI 2 , 5 mM DTT 及适量的NaCl 或KCI （视酶的具体要求而定）。20%的PAGE （7 M尿素）凝胶电泳分析，经放射自显影确定酶切百分率。

本实验采用自连接的寡核苷酸作为对照。若底物有较长的回文结构，切割效率则可能因为出现

发夹结构而降低。

2. 双酶切的问题

参看目录，选择共同的buffer。其实，双酶切选哪种buffer是实验的结果，takara 公司从1979 年开始生产限制酶以来，做了大量的基础实验，也积累了很多经验，目录中所推荐的双酶切buffer

完全是依据具体实验结果得到的。

有共同buffer的，通常按照常规的酶切体系，在37 C进行同步酶切。但BamH I在37 C下有时

表现出star活性，常用30 C单切。

两个酶切位点相邻或没有共同buffer的，通常单切，即先做一种酶切，乙醇沉淀，再做另一种酶

切。

3. 酶切底物DNA ，切不开

1 ）底物DNA 上没有相应的限制酶识别位点，或酶切位点被甲基化。

2 ）PCR 引物的酶切位点前没有保护碱基或引物合成有误，致使没有正确的酶切位点存在。PCR 产物酶切前尽量进行精制以更换buffer 。由于PCR 产物中带入的其它物质，会影响酶切，据报道，通常PCR 产物的添加量占总反应体积25% 以下没有问题。

3 ）酶切条件的确认，包括反应温度和反应体系等。同样的DNA ，同样量，用不同的限制酶切情况可能不同，由于DNA 的空间结构造成的。同样的DNA ，不同的反应体系，酶切效果也可能不同，由于一些空间因素或不可测因素造成的。

4 ）公司出售的限制酶都是液体状态，都是根据最佳反应体系配制了浓度，不可以再用buffer 稀释，因为酶浓度和活性之间不呈直线对应关系，酶浓度越稀，相对活性越低，并且越不稳定，有时便会出现底物DNA 不能被切断的现象。

不同公司的酶和buffer 不要交叉使用，否则可能会影响酶切效果。

5 ）酶的识别位点上的碱基被甲基化。可以选用不受甲基化影响的同裂酶，或将质粒DNA 转入甲基化酶欠损的宿主菌中，重新制备DNA ，也可以使用PCR 的方法对DNA 进行扩增，再做酶切。常用的有XbaI 容易受甲基化影响，通常选用GM33 做宿主菌转化。

6 ）底物不纯，含有限制酶阻害物质，影响酶切作用，需要重新纯化DNA 。一般做乙醇沉淀纯化即可。如果质粒中含盐或酚等，都会影响酶切效果。

4. DNA 经酶切后，电泳无带或出现smear 现象

DNA 或酶切试剂中混有DNase ，在一定的温度或缓冲液的作用下，激发DNase 的作用，将DNA 降解。可以用DNA 上的其他酶，也可以用此酶切其他DNA 来检查问题所在。如果质粒酶切出现此情况，首先将质粒做乙醇沉淀再酶切。

5. 甲基化酶

M.Alu I, M.Bam H I, M.RcoR I 不属于CG 甲基化，dam 甲基化，也不属于dcm 甲基化。

甲基化酶作用后，DNA 不能被相应的酶切断。