第2章细胞工程研究常用设备和技术

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基本实验室-培养室
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二、辅助实验室
• 细胞学实验室：其功能是对培养材料进行细胞学鉴定和研 究。要求清洁、明亮、干燥，使各种光学仪器不受潮湿和 灰尘污染。 • 摄影室及暗室：其功能是进行培养材料的摄影记录和胶片 冲印。在有条件的情况下可建立此实验室。 • 生化分析室：在以培养细胞产物为主要目的的实验室中， 应建立相应的分析化验实验室，以便于对培养物的有效成 分随时进行取样检查。 • 细胞工程实验室布局的其基本要求是：便于隔离、便于操 作、便于灭菌、便于观察。
显微操作系统： 用于对细胞进行 显微操作，如细 胞核移植、染色
体操作、显微注
射、胚胎切割等
工作。
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第三节
一、洗涤技术
1．洗涤液
基本技术
铬酸洗涤液是用重铬酸钾(K2Cr2O7)与硫酸(H2SO4)配 制而成，可根据需要配制成弱、中、强三种。
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弱
用重铬酸钾50g加入蒸馏水1L，加热溶化，冷却
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二、有机化合物
糖类 既可作为C源，又可维持培养基的渗透压。植物组织
培养中常使用蔗糖，在某些特殊培养类型中，亦使用麦芽糖、
葡萄糖、果糖、纤维二糖、甘露糖等。 维生素 为了使培养物生长得更好，根据培养目的不同常在
培养基中添加一种或多种维生素。常用的维生素包括VB1 （盐酸硫胺素）、VB6（盐酸吡哆醇）、Vpp(烟酸)、VH (生
洗方法难于达到清洁度要求，以及手工清洗解决不了的缝隙、
小孔、内腔等。
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三、蒸汽压力消毒器
实验室中最常用的灭菌设备就是高压蒸汽灭菌器。常见 的有立式、卧式和手提式几种。 基本操作步骤： 向锅内注水到规定刻度，注意保持导气管通畅； 将待灭菌物放入锅内，盖紧锅盖； 通电加热，排放冷气； 加热至压力额定值，开始计时； 计时结束，切断电源，自然降压至接近零； 灭菌器盖微开5 min，取出灭菌物；
第二章
细胞工程研究常用设备和技术
实验室设计 主 要 内 容
实验室常用仪器设备
基本技术 培养基及其配制
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第一节、实验室设计
细胞工程实验室它必须满足三个基本的需
要，即：实验准备，包括培养基配制，洗 涤与灭菌等；无菌操作；控制培养。
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一、基本实验室
• 准备室：准备室的功能就是进行一切与实验有关 的准备工作。要求宽敞明亮，通风条件好。
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一、无机盐类
必需元素在体内的生理作用主要包括四个方面：
组成各种化合物，参与机体的建造，成为结构物质；
构成一些特殊的生理活性物质，如植物激素、酶以及酶
的活化剂，参与植物的代谢活动；
元素之间相互协调，以维持离子浓度平衡、胶体稳定、 电荷平衡等生物电化学方面的作用； 发育过程中，影响组织器官的建成；
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八、培养箱
细胞在离体培养时，都需要一定的温度，尤其是哺乳 动物细胞的要求较高，在多数情况下温度变化不能超过 ±0.5℃。 动物细胞培养 恒温培养箱包括能控制和调节温度的
一般培养箱为增加了湿度和CO2调节的二氧化碳培养箱。 植物细胞培养 气候箱。
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增加了照明条件的光照培养箱、人工
金属用品洗涤
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玻璃器皿洗涤
• 新的玻璃器皿上附有游离的碱性物质，其洗涤方法是用 1%的HCl溶液浸泡24h，再用洗涤剂洗刷，然后用清水反 复冲洗，最后用蒸馏水冲洗1～2次，干燥后即可使用。 • 已使用过的试管、烧杯、三角瓶等，先将器皿中的残渣 除去，用清水洗净，再用洗涤剂洗刷，用清水冲洗干净， 最后用蒸馏水冲洗1～2次。 • 用过的吸管、滴管等内径狭小的玻璃制品，需先放入铬 酸洗涤液中浸泡两小时以上，取出后经流水冲洗半小时 左右，再用蒸馏水冲洗1～2次，然后烘干或晾干。
产品的保护。
三级生物安全柜是为生物安全防护等级为4级实验室而设计的，柜体 完全气密，工作人员通过连接在柜体的手套进行操作，俗称手套箱
(Golve box)，试验品通过双门的传递箱进出安全柜以确保不受污染，
适用于高风险的生物试验，如进行SARS、埃博拉病毒实验等。
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传染病的传染性和危害性并不相同，传染病原分为四个危 害等级。 • 第一级危害群微生物：与人类成人健康和疾病无关； • 第二级危害群微生物：引发人类患病，但很少出现严重情 况，通常有预防及治疗方法； • 第三级危害群微生物：引发人类患病，并出现严重或致死 情况，但可能有预防和治疗方法； • 第四级危害群微生物：引发人类患病，并出现严重或致死 情况，但通常无预防与治疗方法，诸如炭疽杆菌、霍乱弧 菌、埃博拉病毒、天花病毒等。
• 接种室：接种室的功能是进行无菌操作。要求封 闭性好，干燥清洁，能较长时间保持无菌。房间 一般不宜过大，其规模根据实验需要而定。接种 室除了出入口和通气口外，其余应密闭。 • 培养室：培养室的功能是对离体材料进行控制培 养。其首要要求是要能控制光照和温度，其次为 防止微生物感染，培养室应保持干燥和清洁。
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根据生物安全防护水平的差异，生物安全柜可分为一 级、二级和三级三种类型。
一级生物安全柜可保护工作人员和环境而不保护样品。 二级生物安全柜是目前应用最为广泛的柜型。二级生物安全柜依照入 口气流风速、排气方式和循环方式可分为4 个级别：A1 型，A2 型， B1 型和B2 型。所有的二级生物安全柜都可提供工作人员、环境和
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四、干热灭菌干燥箱
用于器械和玻璃器皿的干热灭菌或烘干。 使用方法如下：
将待灭菌物放入箱内，注意不要放得太挤，以利空气流通；
关箱门，接通电源，打开开关，旋动恒温调节器至指定温度。 若需鼓风，则应与升温同时开始，不能先升温后鼓风，以免 导致起火或玻璃器皿破裂； 温度上升至指定温度后，维持所需的时间；
物素)、VBc（叶酸）、VB5（泛酸钙）等。
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肌醇
化学名称环己六醇。肌醇本身并没有促进生长的作用，
但它在糖类的相互转化、维生素、激素的利用等方面具有重 要的促进作用，所以它能使培养物快速生长，对胚状体和芽 的形成有良好的影响。
腺嘌呤
腺嘌呤是合成各种细胞分裂素的前体之一，外源添
加腺嘌呤有利于细胞协调自身合成细胞分裂素，有利于细胞 的分裂和分化，促进芽的形成和生长。 氨基酸 氨基酸是蛋白质的组成成分。常用的氨基酸为甘氨
九、显微镜
体视显微镜（解 剖镜）：用于观
察和剥离较小器
官和组织，也可 用来观察愈伤组 织的生长和发育。
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透射显微镜：
物镜在载物台 上方，用于观 察切片、压片、 涂片等。
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倒置显微镜：物镜在
载物台下方，可以从 培养皿、培养瓶或摇 瓶的下方观察培养物， 用来实时观察活细胞 的生长情况。
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热原层，再经过0.22微
米滤膜过滤除菌，得到 超纯水。
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二、超声波清洗器
超声波清洗功能主要是利用超声波在液体中的“空化”
作用，使黏附在物体表面的各类污物剥落，同时超声波在液
体中又能加速溶解作用和乳化作用，再加上合适的清洗剂配
合，就可以达到清洗目的。
超声波清洗效果好、速度快，尤其对于采用一般常规清
后再缓慢加入浓硫酸90ml。 中 用重铬酸钾50g加入蒸馏水100ml，加热溶化，
冷却后再缓慢加入浓硫酸875ml。 强 浓硫酸加热的同时缓慢加入磨碎的重铬酸钾，
直到重铬酸钾达到饱和为止。一般浓硫酸1L加入重铬 酸钾50g。
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2．洗涤方法
不同材料的器械，洗涤方法不同。 玻璃器皿洗涤 塑料用品洗涤
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二、灭菌和消毒技术
物理方法：干热、湿热、射线处理、物理除菌过滤、离
心沉淀等；
化学方法：消毒剂、抗菌素灭菌；
培养基灭菌、玻璃器皿灭菌、金属用具灭菌、接种 室灭菌、外植体灭菌。
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几种常用消毒剂效果比较
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第四节
培养基及其配置
用于植物离体培养的培养基至少包括无机盐；有 机化合物；生长调节剂三大基本组成以及根据不同需 要的其它附加成分。
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第二节
一、水纯化装置
实验室常用仪器设备
用于细胞工程的培养基和其他溶液一般都要用双 蒸水或三次蒸馏水来配置。 实验室常用的纯水装置：不锈钢蒸馏水器、石英 自动纯水蒸馏器、超纯水装置。
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不 锈 钢 蒸 馏 水 器
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超纯水装置
主要由多个过滤部件组
成。水先经过预过滤层
除去粗杂质，然后经过
有机层、去离子层、去
75%酒精擦拭超净台，放入器械，开紫外灯30min， 关闭紫外灯，点燃酒精灯在下火焰方进行操作。
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七、生物安全柜
生物安全柜是为操作原代培养物、菌毒株以及诊断性 标本等具有感染性的实验材料时，用来保护操作者本人、 实验室环境以及实验材料，使其避免暴露于上述操作过程 中可能产生的感染性气溶胶和溅出物而设计的。
灭菌或烘干完毕后切断电源，待温度降至70℃以下时，可开 箱取物；
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五、过滤除菌装置
1. 蔡氏滤器
使用混合纤维素酯微孔滤膜，孔径有0.22微米、0.45 微米等不同规格。蔡氏滤器可分为抽滤式（负压，抽真空） 和加压式（正压，氮气加压）两种。 2. 针头式滤器
针头式加压塑料小滤器的上下部件为螺旋式连接，中 间夹一层微孔滤膜（常用孔径为0.22微米），滤器上部的 进液口可直接接在注射器上，液体经注射器加压进入滤器， 经过膜过滤除菌后，由滤器下部的出液口流出。
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• 载玻片和盖玻片容易破碎，洗涤时不宜用力擦洗，其 洗涤方法是先用清水冲洗，然后放入铬酸洗涤液中浸 泡几小时或用稀铬酸洗涤液煮沸半小时，取出后用清 水冲洗干净，将其储藏在95%的酒精中。 • 塑料用品洗涤：塑料用品一般用合成洗涤剂洗涤，因 其附着力较强，因此冲洗时必须反复多次，最后用蒸 馏水冲洗。 • 金属用品洗涤：金属用品一般不宜用各种洗涤液洗涤， 需要清洗时，一般用酒精擦洗，并保持干燥。
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六、超净工作台
超净工作台的工作原理是利用鼓风机驱动空 气通过高效滤器除去空气中的尘埃颗粒，使空气 得到净化。净化空气徐徐通过工作台面，使工作 台内构成无菌环境。
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超净工作台是以空气过滤去除杂菌孢子和灰尘颗粒
来达到空气净化目的的装置，主要由鼓风机、滤板、操
作台和照明灯组成。
单人和双人，垂直和平流；
酸及多种氨基酸的混合物如水解酪蛋白、水解乳蛋白等。
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三、植物激素
生长素类 常用的生长素有IAA(吲哆乙酸)、NAA (奈乙 酸 )、2,4-D(二氯苯氧乙酸)和IBA(吲哆丁酸)等。
细胞分裂素类 常用的细胞分裂素有KT (激动素)、BA(6卞基腺嘌呤 ) 、 2-ip( 异戊烯氨基嘌呤 ) 、玉米素等。近年来 TDZ（苯基噻二唑基脲）亦作为一种新的细胞分裂素在许多 离体培养研究中使用。
赤霉素类
此外，根据不同培养目的， ABA(脱落酸)、乙烯、B9、 CCC(矮壮素)等生长抑制物质有时也被用于调节培养物的生 长发育过程，如诱导某些变态器官的发生等。
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四、其它物质
天然提取物，如椰乳、番茄汁、YE(酵母提取物) 琼脂 活性炭
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