支原体检测-贴壁细胞培养法

支原体检测
(DNA荧光染色法-贴壁细胞爬片法)
实验原理：利用荧光试剂二苯甲酰胺(Hoechst33258),结合到细胞和支原体DNA,A-T富含区域的特点，在紫外激发束（波长为330～380nm）激发下产生黄绿色荧光的原理，利用荧光显微镜检测细胞中是否存在支原体污染。

实验基本材料准备：
（1）实验仪器：荧光显微镜（莱卡激发波长330～380nm紫外光UV-2A滤光片）；
（2）实验耗材：盖玻片（12×12mm）；载玻片（76×26mm）；甲醇；冰乙酸；荧光染料Hoechst33258；封片液；吸管；六孔板；细胞培养液（MEM完全培养基和五抗生素MEM培养基）；1xPBS；细胞消化液（0.25%胰蛋白酶液）
（3）待检细胞：将待检细胞传1～2代，每次培养3～5d，作为待检样品
（4）盖玻片准备：盖玻片处理同载玻片，擦净后干燥用无菌去离子水2～8℃保存待用。

（5）载玻片准备：玻片置于自来水中加洗涤剂煮20min，然后用自来水冲洗干净，再用去离子水冲洗3次，放入去离子水中2～8℃待用
实验试剂试液配制：
(1)固定液配制:甲醇:冰乙酸（3:1）混匀，现配现用；
(2)二苯甲酰胺荧光染料
(3)封片液；
(4)1×PBS
细胞样品制备及实验步骤
（1）待检细胞处理：
①将长成致密单层的细胞用0.25%的胰蛋白酶+0.05%EDTA消化，800～
1000r/min离心5min，弃上清胰蛋白酶混合液，所沉淀的细胞用1×PBS洗1
次，离心条件相同；用细胞生长液按实验要求稀释至 1×105/ml，加入3ml/
孔至6孔板中（6孔板中事先加入盖玻片），在5%CO2，37℃孵箱中培养3～5
天；
（2）固定：用枪头吸出六孔板中的培养液，用1×PBS清洗六孔板5ml，吸出，加入新配制的固定液5ml，放置5min，吸出；再加新固定液到六孔板中放置10min，用枪头吸出；
（3）清洗细胞：加入5ml蒸馏水至六孔板，3min，清洗三次；
（4）染色：每孔加入33258荧光染料工作液2ml，室温避光放置30min。

用吸管吸弃荧光染料工作液，将细胞面用5ml蒸馏水洗3次，在空气中干燥。

（5）封片：取一个干净的载玻片，滴加封片液一滴，从培养孔中取出盖玻片，将细胞面向下盖在载玻片上面（注意不能产生气泡），制成封片。

（6）结果观察：打开汞灯10min后，用UV激发光（300～380）的滤光镜，用荧光显微镜在400倍镜下观察细胞。

阴性结果：细胞清晰，仅见细胞核呈黄绿色荧光。

阳性结果：除胞核呈黄绿色荧光外，在细胞膜上呈现大小不等、不规则黄绿色荧光小点，可根据出现阳性荧光的细胞数多少，判定污染程度。

实验关键点：
①固定液：甲酸：冰乙酸=3：1现用现配
②载玻片和盖玻片：洗涤干净
③细胞处理：消化细胞要均匀，培养细胞每天观察，控制细胞数量，均匀生长在盖玻片上
④清洗细胞：贴壁缓缓加入洗液，避免吹掉固定好的细胞
⑤染色：避光染色
⑥封片：气泡要排空。