人类单细胞基因组测序

随着现代生物学的发展，基于细胞群体的研究已无法解决细胞异质性的难题。单细胞测序通过对单个细胞进行基因组或转录组测序，解决了1）用组织样本无法获得不同单个细胞的异质性信息、2）样本量太少无法进行常规测序的难题，为科学家研究解析单个细胞的行为、机制、与机体的关系等提供了新方向。

2011 年，《Nature Methods》杂志将单细胞测序列为年度值得期待的技术之一[1]；2013 年，《Science》杂志将单细胞测序列为年度最值得关注的六大领域榜首[2]，单细胞测序已成为科研热点。

目前，单细胞测序主要涉及全基因组DNA、外显子、mRNA以及lincRNA（同时获得lincRNA和mRNA的序列和表达信息）四个方面。

技术路线

技术参数

产品优势

最严格的数据指控标准

诺禾建立了新一代高通量测序平台，包括10台Hiseq X 测序仪，10台Hiseq 2500，从样品检测到文库构建采用最严格的指控标准，从源头保证了数据的可靠性。采用国际认可的全基因组扩增技术

DNA 水平：诺禾致源采用多次退火环状循环扩增技术（MALBAC），MALBAC 扩增具有低偏倚性。最新《Science》

文章比较MALBAC 与MDA 扩增技术，发现MALBAC 扩增后的数据与混合建库的数据质量更为接近（如图1）［3］。该技

术应用于单精子测序，研究成果

［4］已在《Science》杂志发表。RNA 水平：诺禾致源采用SMARTer 扩增技术（美国Clontech 公司原装试剂盒），能够对单个细胞、微量细胞（几个到几千个）和微量Total RNA（10 pg-10 ng）中含PolyA 尾的RNA 全长进行准确而高效地扩增，扩增后的cDNA 片段适用于Illumina 建库测序平台，为单细胞样本的RNA-seq 分析提供了利器。

图2 SMARTer 扩增无3'和5'端偏好性

定制化信息分析

针对不同项目，除了进行标准信息分析外，通过和合作伙伴共同探讨，制定可行的个性化信息分析方案，整合各种主流软件，优化分析结果，以确保结果的准确性及创新性。

丰富的项目经验

团队成员作为通讯作者参与了多项单细胞测序研究，包括单精子全基因组测序［4］，单细胞转录组测序［5］，相关研究成

果在《Science》，《Nature Structural & Molecular Biology》顶级科学期刊上发表。

图1 MALBAC 扩增与

MDA 扩增后的数据比较

应用案例一 单精子全基因组测序探索染色体重组[4]

案例解析

本研究采用最新发明的多次退火循环扩增技术(MALBAC)，对一名亚洲男性及其99 个精子进行了单细胞全基因组测序，测序深度分别为70X 和1X，构建了个人遗传图谱，并分析减数分裂期间同源染色体之间的片段交叉重组(crossover)事件。研究表明个体水平上基因区附近的重组率降低现象是由分子机制决定，而非自然选择的结果。染色体数目异常是造成某些先天性出生缺陷的重要原因。这一研究结果将有助于研究人类染色体重组规律，探索先天性出生缺陷的遗传机理。

图

1 crossover 分布图

癌症研究

........组织器官内细胞基因组的异 质性研究单细胞外显 子组测序单细胞lincRNA 测序

案例二 单细胞全基因组及外显子组测序揭示乳腺癌克隆进化模式[5]

本研究对ER-/PR-/Her2- 及 ER+/PR+/Her2- 两种分子亚型的患者成对采集肿瘤及正常组织样品，对肿瘤组织、肿瘤单细胞分别进行全基因组及外显子组测序。研究发现CNV在单细胞测序结果之间表现出高度相似性，提示染色体重排发生时期较早，在克隆发展过程中稳定传递给子代克隆；SNV在子代克隆间表现出多样性，提示 SNV 是在肿瘤细胞多次分裂增殖的过程中逐渐产生和积累的。此外，通过数学模型和生物信息学手段揭示了两种分子亚型的肿瘤在突变率上存在差异。

图2 对ER+/PR+/Her2-亚型的肿瘤样品进行单细胞及组织测序后的变异结果展示

案例三 单细胞转录组测序绘制人类植入前胚胎和胚胎干细胞转录组图谱[5]

诺禾致源与北京大学合作，通过对不同发育阶段的早期胚胎的90 个单细胞以及人类胚胎干细胞系(hESCs)的34 个单细胞进行了单细胞转录组测序，并进行详尽的生物信息分析。构建了世界上最完整的人类胚胎发育基因表达图谱，检测出了22,687个母源表达基因，在国际上首次成功分离了囊胚阶段胚胎中的三种细胞（上胚层细胞、原始内胚层细胞及滋养外胚层细胞），进一步发现了一批新的细胞分化相关的标志基因。在人类植入前胚胎中发现了两千七百多种全新的lncRNA，其中许多lncRNA 表达具有发育阶段特异性，很可能参与了植入前胚胎发育过程中的细胞命运决定。

[1] de Souza N. Single-cell methods[J]. Nature Methods, 2011, 9(1): 35-35.

[2] Pennisi E. Single-Cell Sequencing Tackles Basic and Biomedical Questions[J]. Science, 2012, 336(6084): 976-977.

[3] Zong C, Lu S, Chapman A R, et al . Genome-wide detection of single-nucleotide and copy-number variations of a single human cell[J]. Science, 2012, 338(6114): 1622-1626.

[4] Lu S, Zong C, Fan W, et al . Probing meiotic recombination and aneuploidy of single sperm cells by whole-genome sequencing[J]. Science, 2012, 338(6114): 1627-1630.

[5] Wang Y, Waters J, Leung M L, et al . Clonal evolution in breast cancer revealed by single nucleus genome sequencing[J]. Nature, 2014, 512(7513): 155-160.

[6] Yan L, Yang M, Guo H, et al . Single-cell RNA-Seq profiling of human preimplantation embryos and embryonic stem cells[J].

Nature structural & molecular biology, 2013.参考文献

图3 胚胎单细胞RNA-seq 数据的层次聚类、PCA

聚类及表达模式聚类结果