第十章植物细胞培养的基本过程和方法共30页
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坏使，细胞才能被染色，因而可以通过细胞被染色与否确 定活性。
原生质体培养方法
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细胞生长指标
1、细胞生长计量: 细胞计数 细胞密实体积 细胞鲜重 细胞干重
2、细胞活力测定
悬浮细胞培养的同步化
细胞同步化：同一悬浮培养体系的所有细 胞都同时通过细胞周期的某一特定时期。
植物细胞在悬浮培养中的游离性较差， 容易团聚进入不同程度的分化状态，因此 要达到完全同步化相当困难。
①体积选择法：通过细胞体积大小分级，
4、原生质体活力检测
目测法：在显微镜下观察，根据细胞形态、流动性确定
原生质体活力。
FDA法：FDA（二乙酸荧光素）是一种非极性物质，能
自由地穿越细胞质膜，在活细胞内，FDA被酯酶裂解即发 荧光（荧光素），由于荧光素不能自由通过质膜，因而可 以在荧光显微镜下通过具荧光的细胞的观察确定细胞活性 。
伊凡蓝法：伊凡蓝不能穿过质膜，只有质膜受到严重损
适于悬浮培养
适于再生植株
如何获得符合要求的愈伤组织？ 1、选择适宜的外植体：胚、胚轴、子叶
是最常用的外植体，特别是幼胚。 2、选择适宜的培养基：生长素浓度很重要
配合一定浓度的细胞分裂素；添加附加物。 3、愈伤组织要进行继代选择：选择疏松性
好、细胞状态好的细胞不断继代培养。
悬浮细胞生长动态：
基本的悬浮培养体系 均是将细胞分散在一 定容积的培养液中进 行，在一个培养周期 不添加培养基。这种 培养体系基本是处于 封闭状态。当一种营 养物质耗尽时，细胞 即停止生长。在这种 悬浮培养体系中，细 胞扩增生长成S形曲 线。
1、细胞平板培养
平板培养(plate culture)：将一定密度的悬
浮细胞接种到一薄层固体培养基中进行培养的技术。
单细胞的分离：用于平板培养的小细胞团不能
超过6个细胞，所以过滤时筛网的网孔大小要合适。
单细胞悬浮液的制备：分离的单细胞经低速
离心，培养液洗涤2次后，调整密度为5×105／ml。
植板：将1份已调整好密度的单细胞悬浮液与4
份35℃的固体培养基充分混合均匀，然后均匀地平
铺于培养皿中，厚度约1~2mm。 封口：用石蜡膜封培养皿。
2、看护培养
看护培养（nurse culture）：是由Muir1954年设计的。
操作方法： 在固体培养基上置入一块 活跃生长的愈组织，再在愈 伤组织上放一小片滤纸，待 滤纸湿润后将细胞接种于滤 纸上。当培养细胞长出微小 细胞团以后，将其直接转至 琼脂培养基上让其 迅速生长
原生质体的制备
基础材料准备 预处理与酶解（或机械破壁） 原生质体收集与纯化 原生质体活力测定
1、用于分离原生质体材料的准备
无菌试管苗叶片
培养细胞
2、预处理与酶解 材料预处理：子叶、下胚轴;叶片;愈伤组织或 胚性悬浮细胞
叶肉原生质体
酶处理： 酶浓度 酶解时间 酶解温度
3、原生质体的收集和纯化 飘浮法：常用的飘浮剂：蔗糖。 沉淀法：常用甘露醇作为渗透压调节剂，先将 酶液洗出干净，再用Percoll飘浮一次。
3、微室培养
它可对单细胞进行活体连续观察。这 一方法也可用于原生质体培养观察细 胞壁的再生和细胞分裂过程。
4、双层滤纸培养 Horsch等（1980）将平板培养与饲
养层培养技术相结合，建立了双层滤纸植 板培养方法。
第五节 原生质体培养
原生质体的特点: ①具有全能性； ②无细胞壁障碍； ③吸收能力强、分泌能力提高； ④可进行细胞融合。
④低温法：冷处理也可提高培养体系中细胞
同步化程度。
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第三节 固定化培养
细胞固定化是将细胞包埋在惰性支持物的内 部或贴附在它的表面。其前提就是通过悬浮 培养获得足够数量的细胞。
方法：吸附法、包埋法
包埋式固定化培养系统：支持物多采用琼 脂、琼脂糖、藻酸盐、聚丙烯酰胺等；
吸附式固定化培养系统：支持物采用尼龙 网、聚氨酯泡沫、中空纤维等材料。
第四节 单细胞培养
悬浮培养不能对某一细胞进行定点观察 和分析，也就不能进行定点选择。因此，在 进行细胞株（种子细胞）选择和需要对细胞 活动跟踪观察的情况下，必须进行真正意义 上的单细胞培养。由于植物细胞的团聚性， 单细胞培养还比较困难。
1、平板培养 2、看护培养 3、微室培养 4、条件培养（双层滤纸培养）
直接将处于相同周期的细胞进行分选，然 后将同一状态的细胞继代培养于同一培养 体系中。
②饥饿法：在一个培养体系中，如果细胞生
长的基本成分丧失，则导致细胞因饥饿而分 裂受阻，从而停留在某一分裂时期。
③抑制法：通过一些DNA合成抑制剂处理
细胞，使细胞滞留在DNA合成前期，当解除 抑制后，即可获得处于同一细胞周期—G1期 的同步化细胞。
果胶酶 增强分散效果
第二节 悬浮培养（cell suspension culture）
悬浮培养是细胞培养的基本方法，是将单个 游离细胞或小细胞团在液体培养基进行培养增殖 的技术。
1、悬浮细胞的诱导---愈伤组织诱导
要求：松散性好，增殖快，再生能力强。其外 观一般是鲜艳的乳白或淡黄色，呈细小颗粒状，松 散易碎。
二、通过愈伤组织诱导获取植物细胞
愈伤组织的概念--P173 形成过程： 1、起始期； （诱导期） 准备进行分裂 2、分裂期；细胞体积变小→分生状态 3、形成期。大小稳定 内部深层细胞开始分裂
怎样从愈伤组织分离得到细胞？
P175 获得愈伤组织后，挑选质量好的愈伤组 织块，用无菌的镊子或小刀分割得到植物小 细胞团，也可以将愈伤组织转移到液体培养 基中，加入经过灭菌处理的玻璃珠，进行振 荡培养，使愈伤组织分散成为小细胞团或单 细胞，然后用适当孔径的不锈钢筛网过滤， 除去大细胞团和残渣，得到一定体积的小细 胞团或单细胞悬浮液。
第一节 植物细胞的获取
细胞来源：1、外植体； 2、愈伤组织
一、从外植体直接分离植物细胞
1、外植体的选择：适当生长期的健康植株、细 胞之间粘连程度小； 叶片组织
2、外植体的前处理： （1）冲刷材料; 流水 几分钟-数小时 吐温 (2) 表面浸润灭菌；超净台 70%酒精 10-30S （3）深层灭菌； 氯化汞 次氯酸钠 （4）无菌水冲洗。 3min/次 3-10次
原生质体培养方法
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细胞生长指标
1、细胞生长计量: 细胞计数 细胞密实体积 细胞鲜重 细胞干重
2、细胞活力测定
悬浮细胞培养的同步化
细胞同步化：同一悬浮培养体系的所有细 胞都同时通过细胞周期的某一特定时期。
植物细胞在悬浮培养中的游离性较差， 容易团聚进入不同程度的分化状态，因此 要达到完全同步化相当困难。
①体积选择法：通过细胞体积大小分级，
4、原生质体活力检测
目测法：在显微镜下观察，根据细胞形态、流动性确定
原生质体活力。
FDA法：FDA（二乙酸荧光素）是一种非极性物质，能
自由地穿越细胞质膜，在活细胞内，FDA被酯酶裂解即发 荧光（荧光素），由于荧光素不能自由通过质膜，因而可 以在荧光显微镜下通过具荧光的细胞的观察确定细胞活性 。
伊凡蓝法：伊凡蓝不能穿过质膜，只有质膜受到严重损
适于悬浮培养
适于再生植株
如何获得符合要求的愈伤组织？ 1、选择适宜的外植体：胚、胚轴、子叶
是最常用的外植体，特别是幼胚。 2、选择适宜的培养基：生长素浓度很重要
配合一定浓度的细胞分裂素；添加附加物。 3、愈伤组织要进行继代选择：选择疏松性
好、细胞状态好的细胞不断继代培养。
悬浮细胞生长动态：
基本的悬浮培养体系 均是将细胞分散在一 定容积的培养液中进 行，在一个培养周期 不添加培养基。这种 培养体系基本是处于 封闭状态。当一种营 养物质耗尽时，细胞 即停止生长。在这种 悬浮培养体系中，细 胞扩增生长成S形曲 线。
1、细胞平板培养
平板培养(plate culture)：将一定密度的悬
浮细胞接种到一薄层固体培养基中进行培养的技术。
单细胞的分离：用于平板培养的小细胞团不能
超过6个细胞，所以过滤时筛网的网孔大小要合适。
单细胞悬浮液的制备：分离的单细胞经低速
离心，培养液洗涤2次后，调整密度为5×105／ml。
植板：将1份已调整好密度的单细胞悬浮液与4
份35℃的固体培养基充分混合均匀，然后均匀地平
铺于培养皿中，厚度约1~2mm。 封口：用石蜡膜封培养皿。
2、看护培养
看护培养（nurse culture）：是由Muir1954年设计的。
操作方法： 在固体培养基上置入一块 活跃生长的愈组织，再在愈 伤组织上放一小片滤纸，待 滤纸湿润后将细胞接种于滤 纸上。当培养细胞长出微小 细胞团以后，将其直接转至 琼脂培养基上让其 迅速生长
原生质体的制备
基础材料准备 预处理与酶解（或机械破壁） 原生质体收集与纯化 原生质体活力测定
1、用于分离原生质体材料的准备
无菌试管苗叶片
培养细胞
2、预处理与酶解 材料预处理：子叶、下胚轴;叶片;愈伤组织或 胚性悬浮细胞
叶肉原生质体
酶处理： 酶浓度 酶解时间 酶解温度
3、原生质体的收集和纯化 飘浮法：常用的飘浮剂：蔗糖。 沉淀法：常用甘露醇作为渗透压调节剂，先将 酶液洗出干净，再用Percoll飘浮一次。
3、微室培养
它可对单细胞进行活体连续观察。这 一方法也可用于原生质体培养观察细 胞壁的再生和细胞分裂过程。
4、双层滤纸培养 Horsch等（1980）将平板培养与饲
养层培养技术相结合，建立了双层滤纸植 板培养方法。
第五节 原生质体培养
原生质体的特点: ①具有全能性； ②无细胞壁障碍； ③吸收能力强、分泌能力提高； ④可进行细胞融合。
④低温法：冷处理也可提高培养体系中细胞
同步化程度。
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第三节 固定化培养
细胞固定化是将细胞包埋在惰性支持物的内 部或贴附在它的表面。其前提就是通过悬浮 培养获得足够数量的细胞。
方法：吸附法、包埋法
包埋式固定化培养系统：支持物多采用琼 脂、琼脂糖、藻酸盐、聚丙烯酰胺等；
吸附式固定化培养系统：支持物采用尼龙 网、聚氨酯泡沫、中空纤维等材料。
第四节 单细胞培养
悬浮培养不能对某一细胞进行定点观察 和分析，也就不能进行定点选择。因此，在 进行细胞株（种子细胞）选择和需要对细胞 活动跟踪观察的情况下，必须进行真正意义 上的单细胞培养。由于植物细胞的团聚性， 单细胞培养还比较困难。
1、平板培养 2、看护培养 3、微室培养 4、条件培养（双层滤纸培养）
直接将处于相同周期的细胞进行分选，然 后将同一状态的细胞继代培养于同一培养 体系中。
②饥饿法：在一个培养体系中，如果细胞生
长的基本成分丧失，则导致细胞因饥饿而分 裂受阻，从而停留在某一分裂时期。
③抑制法：通过一些DNA合成抑制剂处理
细胞，使细胞滞留在DNA合成前期，当解除 抑制后，即可获得处于同一细胞周期—G1期 的同步化细胞。
果胶酶 增强分散效果
第二节 悬浮培养（cell suspension culture）
悬浮培养是细胞培养的基本方法，是将单个 游离细胞或小细胞团在液体培养基进行培养增殖 的技术。
1、悬浮细胞的诱导---愈伤组织诱导
要求：松散性好，增殖快，再生能力强。其外 观一般是鲜艳的乳白或淡黄色，呈细小颗粒状，松 散易碎。
二、通过愈伤组织诱导获取植物细胞
愈伤组织的概念--P173 形成过程： 1、起始期； （诱导期） 准备进行分裂 2、分裂期；细胞体积变小→分生状态 3、形成期。大小稳定 内部深层细胞开始分裂
怎样从愈伤组织分离得到细胞？
P175 获得愈伤组织后，挑选质量好的愈伤组 织块，用无菌的镊子或小刀分割得到植物小 细胞团，也可以将愈伤组织转移到液体培养 基中，加入经过灭菌处理的玻璃珠，进行振 荡培养，使愈伤组织分散成为小细胞团或单 细胞，然后用适当孔径的不锈钢筛网过滤， 除去大细胞团和残渣，得到一定体积的小细 胞团或单细胞悬浮液。
第一节 植物细胞的获取
细胞来源：1、外植体； 2、愈伤组织
一、从外植体直接分离植物细胞
1、外植体的选择：适当生长期的健康植株、细 胞之间粘连程度小； 叶片组织
2、外植体的前处理： （1）冲刷材料; 流水 几分钟-数小时 吐温 (2) 表面浸润灭菌；超净台 70%酒精 10-30S （3）深层灭菌； 氯化汞 次氯酸钠 （4）无菌水冲洗。 3min/次 3-10次