QIAGEN-质粒提取操作

质粒提取操作步骤

——QIAGEN(德国凯杰)质粒提取试剂盒

一、细菌培养物的生长

1. 从琼脂平板上挑取一个单菌落，接种到2-5mL含有适当抗生素的LB液体

培养基中生长。将液体培养基置于37℃，300rpm的摇床中振荡8小时。2. 用LB培养基以1/500~1/1000的比例稀释含菌落的培养基。若为了获得高

拷贝质粒，用100-200ul含菌落液体培养基接种到100ml LB培养基中；若为了获得低拷贝质粒，用250~500ul含菌落培养基接种到250ml LB培养基中。让其在37℃，300rpm的摇床中振荡12-16小时。

二、细菌的收获和裂解

1. 在6000×g，4℃条件下离心15min，收获细菌。

2. 加入10ml Buffer P1重悬细菌。

3. 添加10ml Buffer P2，剧烈晃动离心管4-6次使其彻底混匀，室温放置5min。

4. 加入10ml冰浴的Buffer P3到此溶菌产物中，晃动离心管4-6次使其混匀。

5. 将溶菌产物倒入针口密封的过滤器中，室温放置10min，不要插入活塞。

6. 打开针口的密封盖，轻轻挤压活塞将溶菌产物过滤到一新的50ml离心管中。

7. 添加2.5ml Buffer ER到过滤的溶菌液中，充分混匀10次后冰上孵育30min。

三、质粒DNA的纯化

1. 将QIAGEN-tip 500的柱子挂在另一离心管上，加入10ml Buffer QBT，让管

中溶液慢慢滴下排空。

2. 将第7步冰上孵育的溶菌液加入QIAGEN-tip柱子中让其透过树脂慢慢滴下。

3. 用2×30ml Buffer QC洗QIAGEN-tip柱。

4. 再用15ml Buffer QN洗脱DNA，用离心管收集DNA洗脱液。

5. 加入10.5ml异丙醇到洗脱液中使DNA沉淀下来，混匀。15000×g，4℃离

心30min，离心后小心倒出上清液。

6. 洗DNA用5ml无内毒素-70%乙醇(添加40ml 96%-100%乙醇到试剂盒的无内

毒素水中)，15000×g，4℃离心10min。小心倒出上清液不要碰到质粒。

7. 烘干离心管底部的质粒5-10min。用500ul无内毒素的Buffer TE重新溶解

DNA。