AmpC酶的研究进展

产ESBL与AmpC的耐药谱差别 与 的耐药谱差别
ESBL
耐药谱 对三代头孢 头孢吡肟 哌酮/舒巴坦 哌酮 舒巴坦 哌拉/他唑巴坦 哌拉 他唑巴坦 头霉素 碳青霉烯类 多重 多耐药 多敏感 大多敏感 大多敏感 大多敏感 敏感
AmpC
多重 耐药 敏感 耐药 耐药 耐药 敏感
产AmpC酶细菌感染的患者死亡率显著升高 AmpC酶细菌感染的患者死亡率显著升高
耐药是选择出来的
药物治疗
敏感菌落中存 在着自发的突 变菌株
给予抗菌治疗后 因为敏感菌株的 相继死亡， 相继死亡，突变 菌株被选择出来
耐药的克隆 在过去曾是 敏感的菌落 中生长
在治疗过程中 耐药成为临床 表现
不宜使用第三代头孢
三代头孢菌素是AmpC酶的弱诱导剂，但诱导产生 的低水平的AmpC酶不足以导致对三代头孢菌素的耐 药，而在AmpC基因阳性菌株中使用三代头孢菌素， 可能会筛选出高产AmpC酶的耐药株，导致耐药菌流 行。因此: 合理使用三代头孢菌素是减少 高产AmpC酶突变株引发耐药的关键。
AmpC酶生化特性 AmpC酶生化特性
相对分子量(Mr)介于38-42 KDa。 灭活β-内酰胺酶抑制剂，如对克拉维酸等不敏感. 正在研究开发的硼酸类抑制剂 BRL42715、 RO48-1265、RO48-1220对其有较强的抑制作用。
百度文库 AmpC酶生化特性 AmpC酶生化特性
对青霉素类抗生素除氮脒青霉素（美西林）或脒基青 霉素（替莫西林）外均耐药。 对多种三代头孢菌素和单环类抗生素耐药。 对头霉素类耐药。 对第四代头孢菌素一般表现为敏感。 对碳青霉烯类抗生素敏感。但细菌高产AmpC酶结合外 膜孔蛋白缺失可导致对其耐药。
质粒AmpC酶的世界流行状况 酶的世界流行状况 质粒
非洲 亚洲 欧洲 美洲 ACC-1，CMY-4 ， MOX-1，DHA-1，ACT-1 , FOX-2，CMY， ， ， I/2/6/7/8/9/10/11/15/16/18/21/21/22/26 BIL-1，CMY-2/3/4/5/12/13，DHA-1/2， ， ， ， FOX-2/4，LAT-1/3/4，MOX-2，ACC-1 ， ， ， MIR-1，ACT-I，FOX-1/2/5/6/8/10，CMY， ， ， 2/3/4/5/19/20/23/24/25
pAmpC酶的来源途径推测 酶的来源途径推测
推测质粒介导的AmpC酶基因是来源于染色体的，目 前大量的线索表明可能是通过整合子实现的。 整合子(Integron)是近来新发现的能将耐药基因传 递给其他细菌同时还能接受其他细菌的耐药基因， 是细菌遗传进化天然克隆和表达系统。
1 研究AmpC酶的科学意义 2 AmpC酶的生化特性 3 AmpC酶的基因与表达 4 AmpC酶的发展简史 AmpC酶的检测 5 AmpC酶的检测 6 产AmpC酶菌的治疗与预防
ampR是AmpC的转录调节因子，属于LysR调节子家族。 AmpR在非诱导状态下作为ampC转录的抑制因子，而 在诱导状态下作为转录激活因子存在。 ampD是AmpC表达的负调控基因，位于远处染色体上， 参与肽聚糖代谢。ampD的基因序列与AmpC酶的表现 型密切相关。
AmpC酶的基因构成 酶的基因构成
（3) 持续低产型
部分产AmpC酶的菌株持续低水平的产生AmpC酶, 其原因可能是缺乏ampR基因或ampR基因发生突变,产 生有缺陷的AmpR蛋白,不能在无β内酰胺类存在的条 件下起到抑制子的作用,也不能在有β内酰胺类存在 的条件下起到激活子的作用,故AmpC酶得以持续低水 平表达。
1 研究AmpC酶的科学意义 2 AmpC酶的生化特性 3 AmpC酶的基因与表达 4 AmpC酶的发展简史 AmpC酶的发展简史 5 AmpC酶的检测 6 产AmpC酶菌的治疗与预防
头孢西丁三维试验
将0.5麦氏单位大肠埃希菌ATCC25922菌液涂布 于M-H平板上，取30μg头孢西丁纸片置于平皿中心， 用刀片在离纸片边缘5mm处放射状地由里向外切割一 道狭缝，取40微升受试菌酶粗提取物由里向外加入 狭缝内，尽量避免酶液溢出狭缝。将MH平板放入 35℃孵箱过夜。
头孢西丁三维试验
死亡率% 死亡率% 32%
P=0.03
15%
非耐药菌
产AmpC酶耐药菌 AmpC酶耐药菌
产AmpC酶肠杆菌属感染患者死亡率是非耐药菌感染患者的2倍 AmpC酶肠杆菌属感染患者死亡率是非耐药菌感染患者的2 酶肠杆菌属感染患者死亡率是非耐药菌感染患者的
1 研究AmpC酶的科学意义 2 AmpC酶的生化特性 AmpC酶的基因与表达 3 AmpC酶的基因与表达 4 AmpC酶的发展简史 5 AmpC酶的检测 6 产AmpC酶菌的治疗与预防
β-内酰胺酶：最主要的灭活酶 内酰胺酶：
目前已发现300多种 多种 目前已发现 新的种类不断出现 对β-内酰胺抗生素造成严重威胁 内酰胺抗生素造成严重威胁
临床关注的重要β 临床关注的重要β-内酰胺酶
超广谱β-内酰胺酶(ESBLs) 高产头孢菌素酶(AmpC酶) 碳青霉烯类酶(Ambler B类 金属酶; Ambler A,D类 β-内酰胺酶)
AmpC酶的基因构成 酶的基因构成
由5个不连锁基因即 ampC、ampR、ampD、ampE 和ampG组成 ampC是AmpC酶的结构基因，编码产生AmpC酶蛋白 基因ampR、ampD、ampE、ampG 是AmpC酶的调节基因， 参与调控AmpC酶的合成过程。
AmpC酶的基因构成 酶的基因构成
碳青霉烯类抗生素
亚胺培南，美罗培南等。尽管它们是AmpC酶的强 诱导剂，但它们对AmpC酶高度稳定，能在诱导产生 足量的AmpC酶之前快速地杀死细菌。同时亦能用于 治疗产ESBL肠杆菌属细菌引起的医院感染。
pAmpC酶的来源 酶的来源
系统进化树研究表明：pAmpC酶和某些菌属的 染色体AmpC酶有着高度的同源关系。 根据和不同菌属的染色体AmpC酶的同源关系， pAmpC酶可分为以下5组：
pAmpC酶的分类 酶的分类
弗氏枸橼酸杆菌组 阴沟肠杆菌群组 气单胞菌属组 摩根摩根菌组 蜂房哈夫尼菌组 LAT-1/2/3/4、CMY、 2/3/4/5/6/7/9、BIL-1 、 MIR-1、ACT-1 、 MOX-1/2、FOX-1/2/3/4/5/6、 、 、 CMY-1/8/11 DHA-1/2 ACC-1
后抗生素时代已经来临？！ 后抗生素时代已经来临？！
开发一种新抗生素需要10年 需花费5-10亿美元 一代耐药菌的产生只要2年时间
携带NDM-1的超级大肠埃希菌
细菌耐药的主要机制
孔蛋白改变 主动外排 灭活酶产生 其他机制… 其他机制 靶点改变
灭活酶种类
β-内酰胺酶 内酰胺酶 氨基糖苷类钝化酶: 氨基糖苷类钝化酶 磷酸转移酶、乙酰转移酶和核苷转移酶 磷酸转移酶、 氯霉素乙酰转移酶 其它：磷霉素、 其它：磷霉素、红霉素乙酰化酶 林可霉素、 林可霉素、克林霉素乙酰化酶等
AmpC酶的研究进展 AmpC酶的研究进展
叶 英
1
研究AmpC AmpC酶的科学意义 1 研究AmpC酶的科学意义 2 AmpC酶的生化特性 3 AmpC酶的基因与表达 4 AmpC酶的发展简史 5 AmpC酶的检测 6 产AmpC酶菌的治疗与预防
The prevalence of Infectious Diseases
AmpC酶的检测方法 酶的检测方法
表型检测 基因检测 pAmpC酶确认需分两步: (1) 明确是否为高产AmpC酶 (2) 是否为质粒介导: 通过质粒接合实 验、Southern杂交证实
AmpC酶的检测方法 酶的检测方法
表型检测方法: 头孢西丁敏感实验 头孢西丁三维试验
头孢西丁敏感试验
操作： 操作：按CLSI标准操作 标准操作 判断： 判断：K-B法<18mm，稀释法 法 ，稀释法>16µg/ml为 为 耐药 意义：耐FOX的菌株有可能产生 意义： 的菌株有可能产生AmpC酶 酶 的菌株有可能产生 缺点： 缺点：特异性差
AmpE蛋白充当一个感受器，协助ampD完成对ampC的 阻遏作用，在整个调节系统中居次要地位。 ampG编码转膜蛋白AmpG,具有透性酶活性，感受肽聚 糖量的变化，在AmpC酶的表达中起着向胞浆内传递 诱导信号的作用。
染色体AmpC酶表达类型 酶表达类型 染色体
（1）诱导高产型: 低基础水平和高诱导产生 （2）持续高产型: 高基础水平持续表达， 亦称：稳定的去阻遏表达型 （3）持续低产型: 低基础水平持续表达
不应用β 不应用β-内酰胺酶复合制剂
克拉维酸不抑制AmpC酶，反而为强诱导剂; 舒巴坦和三唑巴坦的抑制效果也非常有限； 故β-内酰胺酶抑制剂的复合制剂不应用于 治疗高产AmpC酶耐药株感染。
第四代头孢菌素
对AmpC酶亲和力较低（较高的Km值） 能快速地通过细菌的外膜屏障与PBP结合
头孢吡肟等四代头孢是优先选用的抗生素。 头孢吡肟等四代头孢是优先选用的抗生素
AmpC酶的检测方法 酶的检测方法
方法虽多，但至目前CLSI仍未制定临床筛 选AmpC酶的标准，随着产AmpC酶的革兰阴性 杆菌引起的耐药性在临床上越来越受到重视， 需要建立一种快速、简便的方法常规筛选 AmpC酶，任务任重而道远。
1 研究AmpC酶的科学意义 2 AmpC酶的生化特性 3 AmpC酶的基因与表达 4 AmpC酶的发展简史 5 AmpC酶的检测 AmpC酶菌的治疗与预防 6 产AmpC酶菌的治疗与预防
我国pAmpC酶的检测状况 酶的检测状况 我国
北京协和医院 首都医科大学 中山医科大学 浙江医科大学 上海市传染病医院 安徽医科大学 ACT-1， CMY-2 ， DHA-1，CMY-2 ， DHA-1,ACT-1,CMY-2 DHA-1，CMY-2/4/11 ， DHA-I， CMY-2 ， DHA-1，ACT-1/2，CMY， ， 2，MOX-4，ACT-6 ， ，
质粒AmpC酶流行背景 酶流行背景 质粒
1989年Bauenfeind等报道了质粒AmpC酶CMY-1， 但没有提供其生化特征。 第一个公认的质粒AmpC酶是1988年在美国普罗维登 斯一家医院由Papanicolaou等从肺炎克雷伯菌中发 现的MIR-1。 从此以每年发现1～3个新质粒的速度增加。
结果判断： 结果判断： 出现ATCC25922箭头样生长， 箭头样生长， 出现 箭头样生长 为三维试验阳性。 为三维试验阳性。 是目前公认的检测 高产AmpC酶的经典方法。 酶的经典方法。 高产 酶的经典方法
AmpC酶的检测方法 酶的检测方法
基因检测法: 1 聚合酶链反应(PCR) 2 核酸杂交(Southern blot) 3 核苷酸序列分析法:是诊断最可靠和发 现新酶的方法
（1）诱导高产型
当有诱导作用的β内酰胺类抗生素存在 的条件下,AmpC酶的产量明显增加,增加的范 围在100～1000倍之间。
（2）持续高产型 ）
原因为去阻遏突变,即调控基因之一的ampD基因 发生突变,产生有缺陷的AmpD蛋白,不能与AmpR调控 蛋白结合形成复合物,AmpR蛋白即以激活子状态发挥 激活作用,引起AmpC酶的大量表达。
1 研究AmpC酶的科学意义 AmpC酶的生化特性 2 AmpC酶的生化特性 3 AmpC酶的基因与表达 4 AmpC酶的发展简史 5 AmpC酶的检测 6 产AmpC酶菌的治疗与预防
AmpC酶的定义 酶的定义
是由革兰阴性细菌(肠杆菌科细菌,铜绿假单胞菌等) 的染色体或质粒介导产生的一类β内酰胺酶，属 Bush分类（底物谱分类法）Group 1，Ambler分类 （分子结构分类法）Class C 首选作用底物是头孢菌素、且不被克拉维酸所抑制, 因此在国内又称作头孢菌素酶。 因可被某些β内酰胺类抗生素诱导产生,又称诱导酶。
AmpC的发展简史 的发展简史
20世纪90年代前，为染色体型。 90年代后发现质粒型，呈持续高表达,并在同种和 不同种细菌间水平播散，造成更严重的耐药性。 质粒型AmpC种类在不断增加，目前已达50余种。 产质粒型AmpC酶细菌：没有或具有不健全AmpC染色 体的细菌种属→具有健全AmpC染色体的细菌。