性别控制技术

性别控制技术

动物的性别控制(sex control)技术是通过对动物的正常生殖过程进行人为干预，使成年雌性动物产出人们期望性别后代的一门生物技术。性别控制技术在畜牧生产中意义重大。首先，通过控制后代的性别比例，可充分发挥受性别限制的生产性状(如泌乳)和受性别影响的生产性状(如生长速度、肉质等)的最大经济效益。其次，控制后代的性别比例可增加选种强度，加快育种进程。通过控制胚胎性别还可克服牛胚胎移植中出现的异性孪生不育现象，排除伴性有害基因的危害。

一、性别控制技术的发展概况

性别控制是一项历史悠久而又朝气蓬勃的生物技术。早在2500年前，古希腊的德漠克利特就提出通过抑制一侧睾丸控制后代性别比例的设想，尽管这种设想非常谎谬，但反映了人类对这一技术的渴望。性别控制技术与性别决定理论的发展密不可分。在20世纪随着孟德尔遗传理论的重新确立，人们提出性别由染色体决定的理论。1923年，Painter证实了人类X和Y染色体的存在，指出当卵子与X精子受精，后代为雌性，与Y精子受精，后代为雄性。1959年Welshons和Jacobs等提出Y染色决定雄性的理论，后来，Jacobs等在1966年发现雄性决定因子位于Y染色体短臂上。1989年，Palmer等找到了Y染色体上的性别决定区(sex determing region of the ychomosome，SRY)，它的长度为35kb，编码79个氨基酸，在不同哺乳动物中有很强的同源性。SRY序列的发现是哺乳动物性别决定理论的重大突破。尽管SRY序列诱导性别分化的具体机理有待深人探讨，但是它对性别控制技术的发展有重要意义。目前哺乳动物性别控制的方法有多种多样，但最有效的方法是通过分离X、Y精子和鉴定早期胚胎的性别来控制后代的性比。

二、哺乳动物的性别控制技术

(一)X、Y精子的分离

1.X和Y精子的差异从20世纪50年代开始，人们就对X和Y精子的大小、带电荷数、密度和活力等作了深入比较研究，但是目前发现除了X精子的染色体的含量高于Y精子和Y染色体上特异的SRY序列外，两者在其他方面没有明显差异。

2.X和Y精子的分离当前X和Y精子较准确的分离方法是流式细胞器分类法，它的理论根据是两类精子头部DNA含量的差异。在家畜中，X精子的DNA含量比Y精子高出3%-4%。根据这一差异，准确的流式细胞分类仪可对X、Y精子进行分离。具体方法是:先用DNA特异性染料对精子进行活体染色，然后精子连同少量稀释液逐个通过激光束，探测器可探测精子的发光强度并把不同强弱的光信号传递给计算机，计算机指令液滴充电器使发光强度高的液滴带正电，弱的带负电，然后带电液滴通过高压电场，不同电荷的液滴在电场中被分离，进入两个不同的收集管，正电荷收集管为X精子，负电荷收集管为Y精子。用分离后的精子进行人工授精或体外受精对受精卵和后代的性别进行控制。

这种方法已用于商品化分离X和Y精子，分离的准确率达90%以上，每小时的分离速度为3-4×106个精子，用收集后的X或Y精子与卵子受精90%以上胚胎发育雌性或雄性后代。美国已有专门公司分离和出售牛和猪的X和Y精子。这一技术目前存在的主要问题是分离速度太慢，按照目前的分离速度，要获得一个输精剂量的牛精子，需花费近20h。如此长的分离时间直接影响精子的活率，导致受胎率下降。除了上述方法外，人们还根据精子表面膜电荷数、头部大小、重量、密度、运动能力和抗原性差异，采用了电泳、密度梯度离心和免疫学等方法分离X、Y精子，但都未能取得满意结果，且重复率差，无法在生产上运用。

(二)早期胚胎的性别鉴定

运用细胞学、分子生物学或免疫学方法可对哺乳动物附植前的胚胎进行性别鉴定，通过移植已知性别的胚胎可控制后代性别比例。目前胚胎性别鉴定最有效的方法是胚胎细胞核型分析法和SRY-PCR法。

1.核型分析法它是通过分析部分胚胎细胞的染色体组成判断胚胎性别，有XX染色体的胚胎通常发育为雌性，而具有XY染色体的发育为雄性。其主要操作程序是:先从胚胎中取出部分细胞，用秋水仙素处理使细胞处于有丝分裂中期，再制备染色体标本，通过显微摄影分析染色体组成，确定胎胎性别。这种方法的准确率可达100%，但是取样时对胚胎损伤大，操作时间长，并且获得高质量的染色体中期分裂相很困难，难以在生产中推广应用。目前，核型分析法主要用于验证其他方法的准确性。

2.SRY片段的PCR扩增法它是近11年发展起来的用雄性特异性DNA探针和PCR扩增技术对哺乳动物早期胚胎进行性别鉴定的一种新方法。其原理和主要程序如下:先从胚胎中取出部分卵裂球，提取DNA，然后用SRY基因的一段碱基作引物，以胚胎细胞DNA为模板进行PCR扩增，再用SRY特异性探针对扩增产物进行检测。如果胚胎是雄性，那么PCR产物与探针结合出现阳性，而雌性胚胎则为阴性。也可以对扩增产物进行电泳，通过检测SRY基因条带的有无判定是雄性或雌性。随着PCR技术的发展，现在只需取出几个甚至单个卵裂球就可进行PCR扩增，鉴定出胚胎的性别，并且准确率高达90%以上。这种方法取样少，对胚胎的损伤小，整个操作可在几分钟内完成，因而在生产中应用非常方便，有很高的商业价值，市场上已有家畜胚胎性别鉴定的试剂盒出售。运用这种方法进行胚胎性别鉴定的关键是杜绝污染，防止出现假阳性。

3.免疫学方法这种方法的理论依据是雄性胚胎存在雄性特异性组织相容性抗原(H-Y抗原)，但是这种抗原的分子性质目前尚无定论，因而结果不稳定，准确率也较低。其方法是先分离H-Y抗原，制备抗体，然后可通过三种方法把雌雄胚胎分离开。

第一种方法是在胚胎培养液中加人抗体和补体,经一段时间培养，继续发育的为雌性，不能发育而退化的为雄性。

第二种方法是先将胚胎与H-Y单克隆抗体处理后，再用荧光素标记的第二抗体处理，然后在荧光显微镜下观察，有荧光的胚胎为雄性，没有荧光的为雌性。

第三种方法是在胚胎发育到桑椹胚阶段向培养液中加人H-Y抗体,继续培养一段时间后，出现囊胚的为雌性胚胎，停留在桑椹胚的为雄性。

由于H-Y抗原是弱抗原，在操作过程中，观察人员的主观影响因素很大，因而结果的误差大，在实际生产中的运用目前还难以实行。

三、性别控制技术的发展前景

从目前的性别决定理论分析，流式细胞器分类法和SRY-PCR扩增法是准确而发展前景广阔的两种性别控制方法。但是，前者由于分离速度太慢而影响其在生产中的应用.目前需要解决的关键问题是提高分离准确率和分离速度，并加强与体外受精和显微授精技术结合提高分离精子的利用率。运用SRY-PCR技术鉴定胚胎性别，关键是提高灵敏度，减少细胞取样对胚胎的损伤，另外，需要加紧研制各种家畜的SRY-PCR 试剂盒，使这种方法的操作简单而实用。